使用Trimmomatic对NGS数据进行质量过滤

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Trimmomatic 软件可以对NGS测序数据进行质量过滤，其去除adapter的功能只是针对illumina的序列，从reads的3’端识别adapter序列并去除，相比cutadapt，少了几分灵活性。但是在过滤低质量序列时，采用了滑动窗口的算法，给定窗口长度和步长，如果该窗口内所有碱基的平均质量值低于阈值，则将该窗口及其以后的碱基全部去除。对于数据量很多的reads, 滑动窗口算法比cutadapt的算法运行速度更快。官网如下

http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic

该软件采用java语言开发，直接下载打包好的jar文件即可。最新版本为v0.38, 官网提供了二进制文件的压缩包，如下所示

下载后，解压缩即可。该软件可以对序列执行以下几种操作

1. 去除adapter序列

在去除adapter时，需要指定一个fasta格式的文件，里面是对应的adapter序列。软件内置了几种常见的illumina adapter 序列文件，详细列表如下

1. NexteraPE-PE.fa
2. TruSeq2-PE.fa
3. TruSeq2-SE.fa
4. TruSeq3-PE.fa
5. TruSeq-3-PE-2.fa
6. TruSeq-3-SE.fa

当然，也可以自定以adapter序列文件。通过ILLUMINACLIP参数指定adapter序列的文件，写法如下

ILLUMINACLIP:TruSeq2-PE.fa:2:30:10

TruSeq2-PE.fa表示查找该文件提供的adapter序列，在查找时，首先执行一个seed match, 就是只在序列中查找adapter的前几个碱基，如果前几个碱基都找不到，就没必要在查找后面的碱基了，通过seed match可以加快运行速度，2表示在进行seed match时，允许的最大错配数；当满足了seed match后，trimmomatic会将adapter 序列的全长与输入序列进行比对，从而识别adapter序列。此时两种模式，palindromeClip模式允许查找adapter序列的反向互补序列，比如双端测序中，R2端序列会包含5’端adapter序列的反向互补序列，30表示该模式下至少需要匹配的碱基数，另外一种叫做SimpleClip模式，只考虑提供的adapter序列，不考虑反向互补，10表示该模式下至少需要匹配的碱基数。

2. 去除低质量序列

trimmomatic 采用滑动窗口的方式去除低质量序列，需要指定滑动窗口的大小和平均质量的阈值，通过SLIDINGWINDOW参数指定，写法如下

SLIDINGWINDOW:4:15

第一个数字4代表滑动窗口的大小为4bp,第二个数字15代表碱基质量阈值为15。如果窗口内4个碱基的平均质量值低于15，该窗口及之后的序列都会被去除。

3. 去除reads 5’端的低质量碱基

通过LEADING参数指定阈值，写法如下

LEADING:3

如果序列头部的碱基质量值低于3，则去除该碱基。

4. 去除reads 3’端的低质量碱基

通过TAILING参数指定阈值，写法如下

TRAILING:3

如果序列尾部的碱基质量值低于3，则去除该碱基。

5. 从序列头部切除指定长度的碱基

通过HEADCROP参数指定长度，写法如下

HEADCROP:5

表示从每条序列的开头切掉5个碱基。

6. 将序列切割成指定长度

通过CROP参数指定长度，写法如下

CROP:120

表示将所有序列截取为120bp的长度。

7. 去除长度过短的序列

长度的阈值通过MINLEN参数指定，写法如下

MINLEN:36

如果序列长度低于36bp,则该序列会被去除。

可以根据自己的需要选择性的执行以上步骤，参数定义的顺序指定了每个步骤被执行的顺序。

对于单端测序数据，基本用法如下

java -jar trimmomatic-0.38.jar SE  
-phred33 input.fq.gz  
output.fq.gz
ILLUMINACLIP:TruSeq3-SE:2:30:10
LEADING:3
TRAILING:3
SLIDINGWINDOW:4:15
MINLEN:36

对于双端测序数据，基本用法如下

java -jar trimmomatic-0.38.jar PE
-phred33
input_forward.fq.gz
input_reverse.fq.gz
output_forward_paired.fq.gz
output_forward_unpaired.fq.gz
output_reverse_paired.fq.gz
output_reverse_unpaired.fq.gz
ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10
LEADING:3
TRAILING:3
SLIDINGWINDOW:4:15
MINLEN:36

·end·

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