stringTie:转录本组装和定量工具

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对于转录组数据而言，最基础的分析就是基因和转录本水平的定量了，定量就是确定一个基因或者转录本的表达量，其中定量的方式有很多种。

最直接的方式就是统计mapping到这个基因/转录本上的reads的个数，将reads数作为表达量。我们称这种表达量为raw count。

在raw count的基础上，利用外显子长度进行归一化，就得到了TPM值的定量方式。对于每个基因，将raw count除了该基因的长度（exon长度之和) , 得到长度归一化之后的表达量。某个基因的TPM值就是利用归一化之后的表达量，计算了一个相对丰度。具体计算公式如下，注意基因长度以k为单位

在raw count的基础上，利用测序量和外显子长度两个因素进行归一化，就得到了RPKM/FPKM值的定量方式。首先将raw count除了mapping 上的所有reads数，得到相对丰度，在除以该基因长度（exon长度之和）, 就可以计算出RPKM值。测试时每一条插入片段称为一个fragment, 对于双端测序，一个fragment 会得到两条reads。

RPKM和FPKM 唯一不同的地方在于raw count的计算，RPKM 计算的是reads 数，而FPKM 值计算的是fragments 数，对于单端测序， fragment 和 reads 的个数是相等的；对于双端测序，reads 数目是fragments 数目的两倍，对于FPKM 而言，即使双端的两条reads都比对上了基因组，在计数时也知计一次，因为两条reads来源于同一个fragment。

具体计算公式如下, 需要注意单位，mapping上的reads 总数以M为单位，基因长度以k为单位。

能够进行定量的软件有很多，本文主要介绍stringTie这款软件。

在早期的转录组数据分析中，最经典的分析策略是tophat+cufflinks+cuffdiff, 这套分析的pipeline会给出基于FPKM值的定量结果，然后进行差异分析,但是随着测序数据量的提高和分析手段的发展，这套分析策略出现了很多的问题。

首先就是tophat的速度很慢，相比新出的比对软件，其速度可以算得上是龟速了，同样的数据量，hisat/star只需要半个小时就可以比对完成，tophat2至少需要5到6个小时；其次，基于FPKM值得到的差异结果和实验手段如qPCR验证的一致性较差。

为了顺应测序和分析的新趋势，原本的开发团队对整个pipeline进行了全面升级, 用hisat 代替tophat, 用stringTie + ballgown 代替cufflinks + cuffdiff。

stringTie 可以看做是cufflinks 软件的升级版本，其功能和cufflinks是一样的 ，包括下面两个主要功能

1. 转录本组装
2. 定量

相比cuffinks, 其运行速度更快。该软件的官网如下

https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml

stringTie的输入文件为经过排序之后的bam文件，常见用法有以下几种

1. 对已知转录本进行定量

对于模式生物，如human, mouse等，通常只需要对已知的转录本定量即可，用法如下

stringtie -p 10 \
-G hg19.gtf \
-o output.gtf  \
-b ballgown_out_dir -e \
align.sorted.bam

-G参数指定参考基因组的gtf文件，-o指定输出的文件，格式也为gtf, -b指定ballgown的输出结果目录，这个参数是为了方便下游进行ballgown差异分析，-e参数要求软件只输出已知转录本的定量结果。

在输出的GTF格式的文件中，对于每个转录本，会给出以下3种表达量

1. coverage
2. TPM
3. FPKM

2. 组装本组装

对于单个样本进行组装，用法如下

stringtie align.sorted.bam
-o assembly.gtf
-p 20
-G hg19.gtf

在组装的转录本中，也会给出定量的结果，对于组装的新转录本和基因，默认采用STRG加数字编号进行区分，示例如下

gene_id "STRG.1"
transcript_id "STRG.1.1"

单个样本组装完成后，会合并所有样本的转录本组装结果，得到一个非冗余的转录本集合，用法如下

stringtie --merge \
-o assembly.gtf \
-p 20 \
-G hg19.gtf \
sampleA.gtf sampleB.gtf

在合并的非冗余转录本中，采用MSTRG加数字编号对基因和转录本进行编号，示例如下

gene_id "MSTRG.2"
transcript_id "MSTRG.2.2"

本质上，stringTie只提供了转录本水平的表达量，定量方式包括TPM和FPKM值两种。为了进行raw count的定量方式，官方提供了prepED.py脚本，可以计算出raw count的表达量，用法如下

python prepDE.py \
-i sample_list.txt  \
-g gene_count_matrix.csv  \
-o transcript_count_matrix.csv

输入文件为sample_list.txt， 该文件为\t分隔的两列，第一列为样本名称，第二列为定量的gtf文件的路径，示例如下

sampleA A.stringtie.gtf
sampleB B.stringtie.gtf

同时输出基因和转录本水平的raw count表达量值。

采用stringTie进行定量，运行速度快是一个优势，同时提供raw count, FPKM, TPM 3种定量方式的结果，也是其最便利的地方。

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