使用clusterProfiler进行GO富集分析

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clusterProfiler是一个功能强大的R包，同时支持GO和KEGG的富集分析，而且可视化功能非常的优秀，本章主要介绍利用这个R包来进行Gene Ontology的富集分析。

进行GO分析时，需要考虑的一个基础因素就是基因的GO注释信息从何处获取。Bioconductor上提供了以下19个物种的Org类型的包，包含了这些物种的GO注释信息

clusterProfiler在做GO分析时，会读取这些包中的GO信息，从这里也可以看出，Bioconductor的生态体系，不同R包的数据传递和依赖组成了其生态环境。

对于以上19个物种，只需要安装对应的org包，clusterProfile就会自动从中获取GO注释信息，我们只需要差异基因的列表就可以了，使用起来非常方便。

在进行富集分析时，支持以下两种算法

1. Over-Representation Analysis

过表达分析其实就是费舍尔精确检验，对于以上19个物种，分析的代码如下

ego <- enrichGO(
 gene          = gene,
 keyType = "ENTREZID",
 OrgDb         = org.Hs.eg.db,
 ont           = "CC",
 pAdjustMethod = "BH",
 pvalueCutoff  = 0.01,
 qvalueCutoff  = 0.05,
 readable      = TRUE)

gene就是差异基因对应的向量，keyType指定基因ID的类型，默认为ENTREZID, 该参数的取值可以参考keytypes(org.Hs.eg.db)的结果， 建议采用ENTREZID, OrgDb指定该物种对应的org包的名字，ont代表GO的3大类别，BP, CC, MF; pAdjustMethod指定多重假设检验矫正的方法，cufoff指定对应的阈值，readable=TRUE代表将基因ID转换为gene symbol。

2. Gene Set Enrichment Analysis

ego <- gseGO(
 geneList     = geneList,
 OrgDb        = org.Hs.eg.db,
 ont          = "CC",
 nPerm        = 1000,
 minGSSize    = 100,
 maxGSSize    = 500,
 pvalueCutoff = 0.05,
 verbose      = FALSE)

GSEA分析通过置换检验来计算p值，nPerm指定置换次数。

对于这19个物种之外的其他物种，也支持读取基因的GO注释文件，然后进行分析，注释文件的格式如下

只需要3列信息即可，第一列为geneID, 第二列为基因对应的GO编号，第三列为GO的描述信息。这3列的顺序是无所谓的， 只要包含这3种信息就可以了。 读取该文件，进行分析的代码如下

data <- read.table(
 "go_annotation.txt",
 header = T,
 sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
# 费舍尔精确检验
x <- enricher(
gene,
TERM2GENE = go2gene,
TERM2NAME = go2name)
# GSEA富集分析
x <- GSEA(
gene,
TERM2GENE = go2gene,
TERM2NAME = go2name)

对于GO富集分析的结果，clusterProfiler提供了以下几种可视化策略

1. barplot

用散点图展示富集到的GO terms,用法如下

barplot(ego, showCategory = 10)

生成的图片如下

横轴为该GO term下的差异基因个数，纵轴为富集到的GO Terms的描述信息， showCategory指定展示的GO Terms的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。注意的颜色对应p.adjust值，从小到大，对应蓝色到红色。

2. dotplot

用散点图展示富集到的GO terms,用法如下

dotplot(ego, showCategory = 10)

生成的图片如下

横轴为GeneRatio, 代表该GO term下的差异基因个数占差异基因总数的比例，纵轴为富集到的GO Terms的描述信息， showCategory指定展示的GO Terms的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。

图中点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色，大小对应该GO terms下的差异基因个数，个数越多，点越大。

3. GO有向无环图

调用topGO来实现GO有向无环图的绘制，代码如下

plotGOgraph(ego)

生成的图片如下

矩形代表富集到的top10个GO terms, 颜色从黄色过滤到红色，对应p值从大到小。

4. goplot

和plotGOgraph展示的信息一样，都是GO有向无环图，只不过采用了igraph中的布局方式，用法如下

goplot(ego)

生成的图片如下

5. emapplot

对于富集到的GO terms之间的基因重叠关系进行展示，如果两个GO terms系的差异基因存在重叠，说明这两个节点存在overlap关系，在图中用线条连接起来，用法如下

emapplot(ego, showCategory = 30)

生成的图片如下

每个节点是一个富集到的GO term, 默认画top30个富集到的GO terms, 节点大小对应该GO terms下富集到的差异基因个数，节点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色。

6. cnetplot

对于基因和富集的GO terms之间的对应关系进行展示，如果一个基因位于一个GO Terms下，则将该基因与GO连线，用法如下

cnetplot(ego, showCategory = 5)

生成的图片如下

图中灰色的点代表基因，黄色的点代表富集到的GO terms, 默认画top5富集到的GO terms, GO 节点的大小对应富集到的基因个数。

更多用法和细节请参考官方文档。

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