minfi 分析甲基化芯片数据 - 预处理篇

生信修炼手册

发布于 2020-05-11 10:53:23

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在芯片分析中，使用探针的信号强度来衡量表达量，但是探针的信号强度会受到噪声的干扰，所以需要去除背景噪声。

差异分析的结果是我们最关注的的结果,为了保证差异分析结果的可靠性，除了保证样本处理和实验阶段的准确性之外，还必须尽可能的减少干扰因素，比如减少技术重复之间的差异，常用的手段就是归一化。

在所有类型的芯片分析中，都会包含去除噪声和归一化两个步骤，合称为预处理。

不论是450K还是850K芯片，都有一系列的control probe。常见的背景降噪算法都是通过control探针的信号强度来校正CpG探针的信号强度。

对于甲基化芯片而言，由于混合了I型探针和II型探针，其归一化策略和其他的芯片会有所不同，必须使用专门的算法。

I型探针和II 型探针之间的差异

450K和850K芯片都混合使用了I型探针和II 型探针，而这两种探针的信号强度的分布并不相同。

技术重复之间的差异

技术重复之间的beta 值分布也有差异，会对差异分析造成影响。

上面的图片摘自以下文章

SWAN: Subset-quantile Within Array Normalization for Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChips

在minfi 中, 提供了许多封装好的函数进行预处理操作，包括以下几种

preprocessRaw

直接使用探针原始的信号强度，不做任何的降噪和归一化操作。用法示例：

> Mset.raw <- preprocessRaw(rgSet)
> Beta.raw <- getBeta(Mset.raw)
> head(Beta.raw[, 1:2])
          5640269011_R01C01 5640269011_R01C02
cg00050873       0.442954145         0.4807018
cg00212031       0.037192982         0.4955224
cg00213748       0.062017215         0.4781491
cg00214611       0.009769379         0.5105634
cg00455876       0.519177321         0.3870192
cg01707559       0.053536392         0.4947322

preprecessIllumina

采用和illumina 公司提供的`Genomestudio 软件相同的背景降噪和归一化算法。用法示例：

> Mset.illumina <- preprocessIllumina(rgSet, bg.correct = TRUE, normalize = "controls")
> Beta.illumina <- getBeta(Mset.illumina)
> head(Beta.illumina[, 1:2])
          5640269011_R01C01 5640269011_R01C02
cg00050873        0.44136148               NaN
cg00212031        0.01514483        0.45161290
cg00213748        0.02828619        0.40000000
cg00214611        0.00000000               NaN
cg00455876        0.52008149        0.08035714
cg01707559        0.03959919        0.49392097

相比原始探针的beta值，预处理之后发生了变化，值得注意的是beta 中产生了NaN, 这是因为降噪的过程中，探针的intensity变成了0。

需要注意的一点就是，getBeta 函数在计算beta值时，公式是beta = M / (U + M + offset), 默认情况下，offset 的值为0，而GenomeStudio计算beta值时，offset是100，如果想要得到和GenomeStudio相同的beta值，在使用getBeata函数时，需要指定offset=100。

preprocessSWAN

采用SWAN 算法进行归一化，用法示例：

> Mset.swan <- preprocessSWAN(rgSet)
> Beta.swan <- getBeta(Mset.swan)
> head(Beta.swan[, 1:2])
          5640269011_R01C01 5640269011_R01C02
cg00050873        0.41484851         0.4373368
cg00212031        0.04521873         0.4455556
cg00213748        0.07077626         0.4259962
cg00214611        0.01518267         0.4695767
cg00455876        0.46695005         0.3344798
cg01707559        0.05960201         0.4046000

preprocessQuantile

用法示例：

Mset.quantile <- preprocessQuantile(rgSet,
   fixOutliers = TRUE,
   removeBadSamples = TRUE,
   badSampleCutoff = 10.5,
   quantileNormalize = TRUE,
   stratified = TRUE,
   mergeManifest = FALSE, sex = NULL)
Beta.quantile <- getBeta(Mset.quantile)
head(Beta.quantile[, 1:2])

preprocessNoob

使用noob 背景降噪和归一化算法，用法示例：

> Mset.noob <- preprocessNoob(rgSet)
Loading required package: IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19
[preprocessNoob] Applying R/G ratio flip to fix dye bias...
> Beta.noob <- getBeta(Mset.noob)
> head(Beta.noob[, 1:2])
          5640269011_R01C01 5640269011_R01C02
cg00050873        0.43735970         0.4972196
cg00212031        0.02977752         0.4992273
cg00213748        0.05049398         0.4955324
cg00214611        0.02711612         0.5015160
cg00455876        0.52250999         0.4750661
cg01707559        0.02868987         0.4919265

preprocessFunnorm

首先使用noob算法降低噪声，然后使用 functional normalization algorithm 进行归一化,用法示例：

> Mset.funnorm <- preprocessFunnorm(rgSet)
[preprocessFunnorm] Background and dye bias correction with noob
[preprocessNoob] Applying R/G ratio flip to fix dye bias...
[preprocessFunnorm] Mapping to genome
[preprocessFunnorm] Quantile extraction
[preprocessFunnorm] Normalization
> Beta.funnorm <- getBeta(Mset.funnorm)
> head(Beta.funnorm[, 1:2])
          5640269011_R01C01 5640269011_R01C02
cg13869341         0.8088316        0.84008819
cg14008030         0.7052135        0.77599014
cg12045430         0.1955532        0.08396006
cg20826792         0.2799878        0.14448866
cg00381604         0.1393622        0.01848330
cg20253340         0.4237887        0.10738351

虽然有这么多的算法可供选择，在实际使用中，对于存在大规模差异的样本，比如癌症和正常人的差异，不同组织的差异鉴定，推荐使用 preprocessFunnorm ；对于小规模的差异，比如同一组织不同处理，推荐使用 processFunnorm。