MarkDuplicates 的意义与作用
在数据预处理中，有一个很重要的步骤就是MarkDuplicates, 字面意思就是标记重复序列。重复序列是如何产生的，为什么要标记重复序列呢？
首先来看重复序列产生的途径，有以下两种
- PCR duplicates 这个很好理解，PCR根据一份模板，扩增出多份拷贝，来源于同一模板的多份拷贝之间就是PCR重复序列
- Optical duplicates illumina测序仪的基本单位是flowcell，测序反应在flowcell上发生和进行，高密度的flowcell使得测序的通量显著提升，也带来了序列重复读取的问题。虽然比例非常低，但是也需要考虑进来。
GATK官方对PCR重复和系统重复进行了统计，可以看到，PCR重复的比例随着测序量的增加而增加，而Optical duplicates 重复序列的比例是一个随机分布，总是存在的，其比例相对稳定，在是在一定范围内波动，符合系统误差的特性。
之所以要标记重复序列，是为了下游的SNP分析。SNP位点的识别，简单理解可以看做一个概率问题。比如下面两种情况：
- 情况A 基因组上某位点碱基为A, 有100条reads 覆盖到该位点。 其中99条都为A, 1条为C;
- 情况B 基因组上某位点碱基为T, 有100条reads 覆盖到该位点。 其中54条为T, 46条为C;
上述两种情况都检测到了两种碱基，是不是意味着检测到了两个SNP位点呢？ 当然不是，情况A中C碱基的比例为1%，很可能是测序错误，当然不能算是一个SNP位点；情况B只从reads分布看，可以认为是一个候选的SNP位点，当然还要分析其他的因素才能判断是否是一个snp位点。从这里也可以看出， reads 的计数对于SNP位点的检测特别的重要。
但是这里的reads 指的是有效reads , 是实际在样本中存在的reads的数目。在计数时，重复序列只计数1次。MarkDuplicates的作用就是标记重复序列, 标记好之后，在下游分析时，程序会根据对应的 tag 自动识别重复序列。
重复序列的判断方法有两种：
- 序列完全相同
- 比对到基因组的起始位置相同
序列完全相同时，认为是重复序列当然没什么大问题。虽然会有同源性，重复序列等因素的影响，但是概率非常之小，基本上可以忽略不计；比对位置相同也认为是重复序列，是因为在测序过程中，会存在测序错误，本身完全一样的序列, 可能测序得到的的reads并不完全相同（可能有几个碱基不同），而且在去除低质量的过程中，也会有所差异（末端切除的低质量碱基数不同）, 所以最终根据比对基因组的结果进行判断。如果序列比对到基因组上的起始位置是相同的，就认为是重复序列。
GATK4 标记重复序列的命令如下：
soft/gatk-4.0.4.0/gatk MarkDuplicates -I input.bam -M metrc.csv -O marked.bam
在输出的bam文件中，借助第二列的flag 来标记重复序列，flag的值是多种情况的叠加，其中1024代表重复序列
samtools flags 1024 0x400 1024 DUP
在生出的bam文件中，通过flag的值可以知道该序列是否为重复序列。
通过flag已经可以知道哪些是重复序列了，对于gatk 下游分析而言，已经足够了。有时我们还会去除掉重复序列，在去除重复序列时，会根据序列的碱基质量值 ，选择一个碱基质量值总和最大的reads 作为代表序列，保留下来。