miRNAseq数据分析这么多年了它的流程也没有固定

五年前我在生信菜鸟团博客分享了 一篇文章学会miRNA-seq分析 ，使用 RNA expression profiling of human iPSC-derived cardiomyocytes in a cardiac hypertrophy model. PLoS One 2014;9(9):e108051. PMID: 25255322 文章里面的 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE60292 数据集，2个分组，共6个样本。

那个时候举例使用的是bowtie2软件比对miRNA的reads到miRBase里面的miRNA序列文件，以及hg38参考基因组，两个策略。后来也看了看很多公司报告，发现大多集中于下游分析，就是拿到了miRNA表达矩阵后的，包括差异分析，靶基因等等。如下所示：

miRNA测序数据分析流程图

我最近在生信技能树分享了几个miRNA的靶向基因的查询工具，分别是：

• microRNAs靶基因数据库哪家强
• 使用miRNAtap数据源提取miRNA的预测靶基因结果
• 对miRNA进行go和kegg等功能数据库数据库注释

但是在回看自己五年前的 一篇文章学会miRNA-seq分析 ，发现反而是上游分析并不具备固定的流程，如果上游分析都有疑问，意味着拿到的miRNA表达矩阵本来是有问题的，后续的下游分析也就无从谈起了。

比如发表在Genome Biol. 2014; 的文章Evidence for the biogenesis of more than 1,000 novel human microRNAs的流程就值得介绍：

测序数据质控环节：

• Sequencing was performed on a HiSeq2000 instrument running TruSeq version 3 chemistry for 50 cycles.
• Base calling and quality score calculation was performed from raw intensities using Illumina’s pipeline version 1.8.1.
• The called reads were trimmed with the command line: fastx_trimmer –f 1 –l 36 and low-quality reads discarded with fastx_artifacts_filter using the options –q 10.
• Adapters were clipped using the AdRec.jar program from the seqBuster suite with the following options: java -jar AdRec.jar 1 8 0.3.

如果要发现新的miRNA，需要比对到参考基因组。

• 使用bowtie –f –v 0 –a –m 5 --strata --best; 比对miRNA的FASTA文件到人类参考基因组
• 删除属于annotations of tRNA or rRNA (RepeatMasker hg19)和 known miRNA hairpins (miRBase version 19)的已知miRNA

值得注意的是，small interfering RNA (siRNA), Piwi interacting RNA (piRNA) and microRNAs (miRNAs) 需要区分开来哦，我们现在说的是miRNAs相关的 测序数据分析。

但是绝大部分人在处理miRNA测序数据的时候，并不会有那个时间来仔细琢磨这个数据处理流程。所以，如果你仔细看流程，会发现千奇百怪的数据处理。

有tophat2比对

在文章 Distinct methylation levels of mature microRNAs in gastrointestinal cancers 可以看到：

tophat2比对miRNA

但是现在的你，可不能照抄哦，五年前我在生信菜鸟团博客写过一个《RNA-seq流程需要进化啦》，上面分享过：

Tophat 首次被发表已经是6年前 Cufflinks也是五年前的事情了 Star的比对速度是tophat的50倍，hisat更是star的1.2倍。 stringTie的组装速度是cufflinks的25倍，但是内存消耗却不到其一半。 Ballgown在差异分析方面比cuffdiff更高的特异性及准确性，且时间消耗不到cuffdiff的千分之一 Bowtie2+eXpress做质量控制优于tophat2+cufflinks和bowtie2+RSEM Sailfish更是跳过了比对的步骤，直接进行kmer计数来做QC，特异性及准确性都还行，但是速度提高了25倍 kallisto同样不需要比对，速度比sailfish还要提高5倍！！！

bowtie比对第1篇文章

好奇怪，一直有人坚守bowtie，而不是bowtie2，我猜测是不是因为这个bowtie有一个特殊的功能，是bowtie2所不具备的。

A Panel of MicroRNAs as Diagnostic Biomarkers for the Identification of Prostate Cancer

描述如下：

bowtie比对miRNA

bowtie比对第2篇文章

Expanding the repertoire of miRNAs and miRNA-offset RNAs expressed in multiple myeloma by small RNA deep sequencing

bowtie比对第2篇文章

bowtie比对第3篇文章

hsa-miR-9-3p and hsa-miR-9-5p as Post-Transcriptional Modulators of DNA Topoisomerase IIa in Human Leukemia K562 Cells with Acquired Resistance to Etoposide

bowtie比对第3篇文章

使用BWA软件的

见发表在 Nucleic Acids Res. 2016 Jan 8; 的文章 Large-scale profiling of microRNAs for The Cancer Genome Atlas：

• Our adapter-trimming algorithm identified as long an adapter sequence as possible, allowing a number of mismatches that depended on the adapter length found.
• Because the shortest mature miRNA in miRBase v16 is 15 bp, we discarded any trimmed read that was shorter than 15 bp.
• We used BWA-MEM with parameters samse -n 10 to align the remaining reads to a reference genome, which, for most TCGA cancers, was GRCh37

总结一下，目前是bowtie软件来比对miRNA的reads居多。

如果大家有趁手的miRNA上游分析流程

欢迎共享哦，比如大家可以看到的tcga数据库的mRNA Analysis Pipeline ，详细代码：

• https://docs.gdc.cancer.gov/Data/Bioinformatics_Pipelines/Expression_mRNA_Pipeline/

太复杂的流程就算了，比如上面提到的发表在 Nucleic Acids Res. 2016 Jan 8; 的文章的流程：

• https://github.com/bcgsc/mirna

普通人一辈子也就是处理两三次miRNA数据，并不是TCGA计划那样专业的团队，所以我们仅仅是关心测序reads的清洗问题，接头去除，以及比对的策略。定量之后的表达矩阵分析，反而是很简单的。