魔鬼与天使：CD4 +效应记忆性T细胞在生命早期促进肠道发育并介导炎症

文章信息

今天分享的这篇文章2019年2月发表在期刊Immunity上，题为：Human Fetal TNF-α-Cytokine-Producing CD4+ Effector Memory T Cells Promote Intestinal Development and Mediate Inflammation Early in Life。文章非常有借鉴意义。

总览

Graphical Abstract 首先就揭示了该研究的核心内容：CD4+T细胞在早产儿肠道中的双面性

一面“天使”：多项研究表明CD4+Tem细胞在早期可以促进肠道发育，干细胞增殖。

一面“魔鬼”：CD4+Tem细胞产生的TNF-α介导肠道炎症，导致坏死性小肠结肠炎产生。

主要结果

胚胎期肠道上皮含有CD4+T细胞

首先通过流式检测妊娠13周至20周的胎儿肠道组织：

At 13 weeks of gestation, the earliest time point in this study, CD3+ T cells were already detected in the intestinal epithelium and lamina propria. Single-positive CD4+ CD8- T cells made up 36% (interquartile range [IQR] 21%–47%) of epithelium-derived T cells and 57% (IQR 51%–62%) of lamina-propria-derived T cells. Intestinal CD4+ T cells were almost all (over 95%) αβ T cells.

并且胚胎期肠道上皮含有CD4+T细胞是人类所特有的，在小鼠胚胎期E19.5天的肠道中没有检测到T细胞。

同时出生后早产儿肠道上皮组织中含有更丰富的CD4+T细细胞。

胎儿肠道中CD4+T细胞类型主要为效应记忆性T(Tem)细胞

外周血中T细胞分化遵循线性途径，主要从幼稚CD4+T细胞开始逐渐分化。但是在胎儿肠道中主要为CD45RA-CCR7-CD4+ T cells.

这里给大家稍微介绍下这个标记分类：根据CD45RA和CCR7的表达，CD4+T细胞可分为Tnaive(CD45RA+CCR7+), Tcm(CD45RA-CCR7+)和Tem(CD45RA-CCR7-)三群。

胎儿肠道组织中CD4+Tem细胞表达CD69和CD103，但programmed cell death 1 (PD1)低表达

首先CD69和CD103代表T细胞是否anchored in tissues，而PD1大家比较熟知的是作为肿瘤治疗中的PD1抑制剂，可以激活机体免疫系统，同理，胎儿肠道组织中PD1持续低表达，表示CD4+T细胞在胎儿期肠道组织中非常活跃（

little attenuation of intestinal fetal CD4+ T cells through PD1）。

胎儿肠道组织中CD4+T细胞的特征是产生TNF-α

同时IL-4是外源血CD4+T细胞的特征，在胎儿和早产儿肠道中CD4+T的IL-4没有差异，此外使用PMA-ionomycin刺激后发现，胎儿肠道CD4+T细胞不产生IL-17α，而婴儿肠道CD4+T细胞可以产生IL-7α.

单细胞测序检测胎儿肠道CD4+T细胞转录组表达水平

样本量：2个胎儿肠道共2147个CD4+T细胞，4个婴儿肠道共753个CD4+T细胞

这里先不看结论，先看材料与方法中关于胎龄、肠道组织获得以及单细胞筛选条件：

• 首先使用PBS清洗肠系膜淋巴结，排除掉非肠道组织内的淋巴系统，
• 随后剪碎肠道组织，在37℃Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM; Lonza) 培养基中加入 1 mg/ml(0.15 U/mg) Collagenase D (Roche), 1% fetal bovine serum (FBS; Biological Industries), and 1000 U/ml DNAse type I (WorthingtonBiochemical Corporation)消化2X30min，
• 随后使用70mm滤网过滤获得单细胞悬液，
• 随后加入淋巴细胞分离液，通过梯度离心法获得淋巴细胞，

细胞分选使用的4-laser FACS Aria IIu SORP：

CD4+Temcells (viableCD45+3+4+CCR7- CD45RACD45R0+ )

non-effector cells (viable CD45+ 3+ 4+ CCR7+ )

单细胞分析：

采用的之前我介绍过的Seurat标准分析流程，

Cells with less than 100 detected genes &genes expressed in less than 50 cells&cells with more than 25% of reads from mitochondrially encoded genes 符合以上3个条件之一的细胞被剔除。

（PS：这个文章中使用的剔除方案是非常宽松的，并且没有使用双细胞剔除，可能考虑到测序获得的T细胞较少。同时把含有myeloid cell markers的细胞剔除，排除血液外周来源的T细胞。）

采用P<0.05计算婴儿、胎儿以及刺激与非刺激间的差异基因，随后使用clusterprofiler进行Go富集（该R包由Guangchuang Yu，南方医科大学生物信息学教授编写，做差异基因功能的肯定都知道这个R包，强烈推荐），同时采用了AUCell算法整理了GO结果，确实图比气泡图漂亮，值得参考。

这一部分的主要发现胎儿肠道CD4+T细胞含有Th1细胞分化和肠道长皮成长相关的基因表达谱，展现了早期CD4+T细胞的“天使面孔”。

TNF-α对于肠道干细胞（ISC）发育具有Dose-Dependent Effect

该研究中从胎儿肠道组织中分离出ISC，然后进行培养，在培养过程中加入TNF-α（胎儿肠道CD4+T细胞产生的主要细胞因子）来评估TNF-α对肠道发育的影响，结果显示肠道胎儿CD4 + Tem细胞对ISC增殖具有剂量依赖性和TNF-α介导的作用。该作用在生理条件下支持肠上皮的生长和发育，但可以高浓度下阻滞肠道上皮生长。

早产儿肠道炎症时TNF-α表达增加

进一步取了6例NEC患者肠道组织进行了流式和免疫组化分析，显示早产儿NEC肠组织中的CD4 + T细胞具有效应记忆表型，并优先产生TNF-α。进一步确定NEC组织中是否表达了TNF-α和TNF信号下游的基因，定量了NEC组织中的mRNA表达，显示与足月出生的婴儿相比，NEC患者来源的组织中的TNFA，NFKBIA，TNFAIP2和TNFAIP3基因显着增强，这与较高的TNF-a信号传导相符。

总结

到这里，该研究就结束了，这个研究属于层层递进，从胎儿到正常早产儿再到NEC早产儿，研究之间肠道相关免疫的变化，相关的试验方法和手段都值得借鉴~尤其广泛的流式细胞计数应用以及相关数据的处理方法都值得学习~