Advanced Science：miRNA靶点天然产物虚拟筛选策略

香港中文大学中医学院张保亭教授在“Advanced Science”发表靶向非编码核酸miRNA靶点的天然产物虚拟筛选新策略。

由香港中文大学中医学院张保亭教授（通讯作者）领衔，香港浸会大学罗守辉骨与关节疾病转化医学研究所（TMBJ）张戈教授（共同通讯作者）以及香港浸会大学整合生物信息医学与转化科学研究所(IBTS)吕爱平教授（共同通讯作者）参与组成的联合研究团队，最近在针对非编码核酸miRNA靶点的天然产物虚拟筛选的药物发现新策略领域获得重要进展，相关成果发表在国际学术期刊“Advanced Science”（影响因子：15.804）。

张保亭教授（香港中文大学）介绍：非编码核酸miRNA是真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的核糖核酸（RNA）分子，可以调节基因的表达。 miRNA从DNA转录而来，是一种无法进一步转译成蛋白质的RNA。miRNA能够通过与特定的靶mRNA相互作用，同时引导AGO蛋白来抑制甚或降解靶mRNA，从而干扰和阻断相应的靶蛋白的翻译。大量研究证实miRNA在许多病理生理过程中发挥重要的贡献作用。常用的药物虚拟筛选策略都是基于蛋白的三维结构设计的计算模型，由于miRNA的柔性太大，目前缺乏针对miRNA的药物虚拟筛选模型，导致近年以来大量被发现参与疾病分子机制的非编码核酸miRNA靶点无法实现向药物发现转化。

张保亭教授进一步介绍：我们通过对不同种属的miRNA数据库的分析，发现miRNA与mRNA在相互作用的过程中可以形成一种独特的loop结构。这种loop结构与其引导的AGO蛋白在空间位置上非常接近，miRNA与mRNA以及AGO蛋白组成的复合体具有成为药物靶点的高度的结构特异性（structure-based）。根据已经发表的可以结合病毒核酸结构的小分子的信息知识（Knowledge-based），虽然这些病毒核酸结构与miRNA在功能上存在不同，但是它们在序列性质上都是RNA，由此可以通过机器学习的方法来预测可以结合miRNA靶点的小分子化合物。因此，我们提出一种能够同时结合基于结构途径（structure-based）和知识途径（Knowledge-based）来针对miRNA靶点进行虚拟药物筛选的策略。在明确了虚拟筛选策略以后，就需要考虑供筛选的小分子化合物的来源。中药来源的天然产物的结构多样性是药物先导化合物的源泉，从浩瀚的中药以及天然产物中筛选能够靶向由miRNA与mRNA以及AGO蛋白组成的复合体的先导化合物无疑是非常值得期待的（图1和图2）。

图1. 基于知识途径和基于结构途径靶向miRNA-mRNA-AGO复合体的虚拟筛选模型。a)基于知识途径的虚拟筛选方法原理图。b)基于结构途径的虚拟筛选方法原理图。c)重量套索评分系统，结合基于知识和基于结构的可能性，对候选分子进行排序。

图2. 小分子靶向miRNA-mRNA-AGO复合体的潜在作用机制。（上）miRNA引导AGO进入靶mRNA的3’-未翻译区（3’-UTR）形成miRNA-mRNA环，然后裂解mRNA。（下）预测的小分子可以影响AGO引导的miRNA与目标mRNA形成的loop环，或直接影响AGO介导的miRNA-mRNA形成的loop环附近的AGO蛋白，从而发挥挽救mRNA翻译抑制的剪切功能。

张戈教授（香港浸会大学罗守晖骨与关节疾病转化医学研究所）在非编码核酸miRNA在骨代谢疾病发生中作用及分子机制研究方面有很扎实的工作基础，包括发现miRNA214在成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收中的作用（Wang X, et al. Nature Medicine 2013; Li D, et al. Nature Communication 2016) 。香港浸会大学整合生物信息医学与转化科学研究所吕爱平教授（黄英豪博士中医药讲座教授）收集、构建了海量的中药来源天然产物数据库。张保亭教授介绍：我们与香港浸会大学张戈教授和吕爱平教授合作，应用上述虚拟筛选策略在天然产物库中针对参与骨代谢疾病发生发展的miRNA靶点开展了高通量的虚拟筛选和实验验证的工作。

论文的第一作者，香港中文大学中医学院90后研究员卓振建博士介绍说：我们从浩瀚的中药以及天然产物数据库中分别找到两类化合物集，可以分别靶向miRNA214-ATF4-AGO复合体和miRNA214-TRAF3-AGO复合体，然后通过一系列体外细胞活性验证实验，我们筛选到一个天然产物小分子OB-4（来源于槐）（图3）。应用张戈教授团队设计的成骨细胞靶向递送系统（Zhang G, et al. Nature Medicine 2012; Liang C, et al. Nature Medicine 2015）携带OB-4靶向作用于成骨细胞，可以缓解成骨细胞特异性miR-214转基因小鼠的成骨能力下降的表型（图5）；我们还筛到另一个天然产物小分子OC-3（来源于芸香）（图4），应用张戈教授团队设计的破细胞靶向递送系统（Liu J, et al. Biomaterials 2015）携带OC-3作用于破骨细胞，可以逆转破骨细胞特异性miR-214敲入小鼠骨吸收能力增强的骨表型（图6）。令人产生兴趣的是同一个miRNA214，作用于不同的mRNA（在成骨细胞是ATF4 mRNA，在破骨细胞是TRAF3 mRNA），虚拟筛选获得打分高值的化合物在结构上存在巨大差异，提示上述筛选策略在天然产物库中的虚拟筛选具有高度特异性，可望高效筛选发现靶向非编码核酸miRNA靶点的药物。

图3. 化合物OB-3结构及植物来源。（左）OB-4: Quercetin-3-O-D-glucosyl]-(1-2)-L-rhamnoside;（右）Sophora japonica L.

图4. 化合物OC-3结构及植物来源。（左）OC-3: 7-Hydroxyflavone-beta-D-glucoside;（右）Ruta graveolens L.

图5. 化合物OB-4靶向成骨细胞miR-214-ATF4mRNA，解除miR-214对成骨细胞骨形成的抑制。

图6. 化合物OC-3靶向破骨细胞miR-214-TRAF3mRNA，抑制miR-214对破骨细胞的激活。

论文的共同第一作者香港浸会大学整合生物信息医学与转化科学研究所的万悠扬研究员介绍：通过加入到张戈教授的研究团队以后开展了通过知识途径（Knowledge-based），也就是应用机器学习算法（学习已经建立的病毒核酸与小分子的相互作用）给出能够预测与loop（miRNA与mRNA非互补区）以及AGO作用的小分子，其中knowledge-based模块通过对Logistic Regression (LR), Linear Discriminant Analysis (LDA), K-Nearest Neighbors (KNN), Classification and Regression Trees (CART), Naive Bayes(NB), Support Vector Machine(SVM) and Random Forest (RF)共7种常见机器学习算法的竞争，最后选用随机森林算法学习所设计的特征，完成了对该模块的构建（表1 不同机器学习算法在accuracy 在 roc_auc下的表现）。进一步再通过结构途径（structure-based），即根据结合自由能大小提供小分子预测结果和相应的结合位点。随后的小分子与loop结合的质谱鉴定结果以及基于AGO蛋白的pull down实验证实了我们的虚拟筛选新策略的可靠性。

表1. 不同机器学习算法的表现.

中国科学院院士、上海药物研究所蒋华良教授对于这项工作给出了评语：这项研究提供了基于非编码核酸miRNA的药物发现的虚拟筛选策略，犹如现代神农在浩瀚的中药来源的天然产物中“尝百草”。

中华中医药学会中药实验药理学会主任委员、上海中医药大学药学院院长徐宏喜教授对于这项工作给出评语：这项研究对于阐述中药来源的天然产物在疾病治疗可能存在的新颖的分子机制提供了高效的预测工具。

国家重点研发计划（2018YFA0800804）首席科学家、中华医学会骨质疏松与骨矿盐疾病分会常委及基础与转化医学组组长、陆军军医大学陈林教授高度评价本工作在骨骼等疾病防治中的重大意义：本研究工作对于推进在骨科疾病的病理生理机制中发挥关键作用的非编码核酸miRNA靶点从基础研究向靶向新药开发具有重要意义。国家重点研发计划在这个方向上投入了可观的资源，中华医学会骨质疏松与骨矿盐疾病分会基础与转化医学组将牵头推动让更多基础研究科学家免费在线使用本项工作涉及的计算技术。

中华医学会骨质疏松和骨矿盐疾病分会主任委员、上海交通大学附属第六人民医院临床研究中心执行主任兼骨质疏松和骨病科主任、中国骨代谢与骨病临床诊疗权威章振林教授对于这项工作的评语：中国骨代谢临床医学科学家从临床样本中积累了大量的患者的非编码核酸miRNA异常的信息，目前大部分仍然停留在临床标志物以及分子机制的研究范畴，这项研究对于拓展非编码核酸分子向临床治疗转化具有重要意义，期待早日造福患者。

本项研究获得国家重点研发项目（2018YFA0800804）、香港研究基金（14112915、14108816）、香港中文大学直接资助基金（4054220、4054138）以及深圳市科学技术创新委员会基金（JCYJ20160229210357960）的资助。美国斯克里普斯研究所（Scripps Research Institute）化学系Matthew D. Disney教授为这项研究提供了Inforna数据库和miRNA motif服务器的使用权限。

香港中文大学医学院中医学院张保亭教授实验室：张保亭教授实验室聚焦于肌肉骨骼系统疾病的分子机制探索及转化研究。包括1）肌肉萎缩性疾病（增龄性肌肉减少症、失应力性肌肉萎缩）的非编码分子靶点的研究及针对此类靶点的天然产物药物发现；2）针对骨骼疾病中非编码核酸靶点的虚拟筛选计算及天然产物的药物发现；3）靶蛋白与适配子相互作用的结构生物学研究、相应天然产物的药物发现及天然产物与靶蛋白潜在相互作用研究；4）杜氏肌营养不良症潜在治疗靶点的发现及适配子和天然产物药物发现；5）靶向肌肉细胞适配子的筛选研究。

原文标题

Zhenjian Zhuo, Youyang Wan, Daogang Guan, Shuaijian Ni, Luyao Wang, Zongkang Zhang, Jin Liu, Chao Liang, Yuanyuan Yu, Aiping Lu (corresponding author), Ge Zhang (corresponding author), and Baoting Zhang (corresponding author). A Loop-based and AGO-incorporated Virtual Screening Model Targeting AGO-mediated miRNA-mRNA Interactions for Drug Discovery to Rescue Bone Phenotype in Genetically Modified Mice. Advanced Science (in print)

张戈 教授

香港浸会大学教授、香港浸会大学罗守晖骨与关节疾病转化医学研究所副所长、粤港澳大湾区适配子转化医学与药物发现国际合作平台执行主任。

张保亭 教授

香港中文大学医学院副教授、香港中文大学中医学院助理院长

吕爱平 教授

香港浸会大学黄英豪博士中医药讲座教授、香港浸会大学中医药学院院长、香港浸会大学整合生物信息医学与转化科学研究所所长

参考文献

Wang X, Guo B, Li Q, Peng J, Yang Z, Wang A, Li D, Hou Z, Lv K, Kan G, Cao H, Wu H, Song J, Pan X, Sun Q, Ling S, Li Y, Zhu M, Zhang P, Peng S, Xie X, Tang T, Hong A, Bian Z, Bai Y, Lu A, Li Y, He F, Zhang G (Corresponding author), Li Y (Corresponding author). miR-214 targets ATF4 to inhibit bone formation.Nat Med. 2013 Jan;19(1):93-100.

Zhang G (corresponding author), Guo B, Wu H, Tang T, Zhang BT, Zheng L, He Y, Yang Z, Pan X, Chow H, To K, Li Y, Li D, Wang X, Wang Y, Lee K, Hou Z, Dong N, Li G, Leung K, Hung L, He F, Zhang L (Corresponding author), Qin L (Corresponding author). A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy.Nat Med. 2012 Jan 29;18(2):307-14.

Liang C, Guo B, Wu H, Shao N, Li D, Liu J, Dang L, Wang C, Li H, Li S, Lau WK, Cao Y, Yang Z, Lu C, He X, Au DW, Pan X, Zhang BT, Lu C, Zhang H, Yue K, Qian A, Shang P, Xu J, Xiao L, Bian Z, Tan W, Liang Z, He F, Zhang L (Corresponding author), Lu A (Corresponding author), Zhang G (Corresponding author). Aptamer-functionalized lipid nanoparticles targeting osteoblasts as a novel RNA interference-based bone anabolic strategy. Nat Med. 2015 Mar;21(3):288-94.

Liu J, Dang L, Li D, Liang C, He X, Wu H, Qian A, Yang Z, Au DW Chiang MW, Zhang BT, Han Q, Yue KK, Zhang H, Lv C, Pan X, Xu J, Bian Z, Shang P, Tan W Liang Z, Guo B, Lu A (Corresponding author), Zhang G (Corresponding author). A delivery system specifically approaching bone resorption surfaces to facilitate therapeutic modulation of microRNAs in osteoclasts.Biomaterials. 2015 Jun;52:148-60.

Li D, Liu J, Guo B, Liang C, Dang L, Lu C, He X, Cheung HY, Xu L, Lu C, He B, Liu B, Shaikh AB, Li F, Wang L, Yang Z, Au DW, Peng S, Zhang Z, Zhang BT, Pan X, Qian A, Shang P, Xiao L, Jiang B, Wong CK, Xu J, Bian Z, Liang Z, Guo DA, Zhu H, Tan W, Lu A (Corresponding author), Zhang G (Corresponding author). Osteoclast-derived exosomal miR-214-3p inhibits osteoblastic bone formation. Nat Commun. 2016 Mar 7; 7:10872.