芒果实验室，细胞冻存不应该成为远行的沙粒

阻挡你前进的不一定是高山大海，而往往是鞋底一粒小小的沙粒！

细胞培养绝对是个技术活，跟智商关系不大。如果细胞没养好，不管是细胞系还是原代细胞，都说明没有掌握技巧。技术活，当然最好有师傅带入门，但是临床医生做科研，哪怕是最简单的细胞培养，也常常要自己摸索，或者是从不是那么专业、规范的师兄师姐那里学习。

细胞培养最好的老师，多是生物背景出身的专职科研人员，而不是医学背景的上级医师们。在细胞培养技术进阶到一定程度，支原体污染是一个难题，还有一个问题是细胞储存问题。

支原体污染最有可能出现问题的就是细胞传代前准备工作部分。避免支原体污染，最主要还是从无菌操作入手，定期检测支原体，定期消毒培养箱和工作台，避免多细胞交叉污染，规范操作。那么细胞冻存，问题又在哪里呢？

一是冻，尤其是最开始从4℃到-20℃的阶段。正常情况下，经过-20℃ 1h30min这一步后，冻存管内的细胞已经处于凝固状态，如果此时冻存管内还是液体，很可能是DMSO或冰箱冷冻功能出现了问题。如若遇到这种情况，不能因为时间到了，就把把液体状态的冻存管放置到液氮中，可以适当延长在-20℃环境下的冷冻时间30-60分钟，直至冻存液凝固后再放到液氮中。（来自网络）

二是存，一旦存放在-80℃或液氮，禁止反复（不要超过3次）、长时间取出（超过30秒）。

个人认为最需要注意的事项：

1、冻存时机：细胞状态不好（长过了或连续培养超过二个月）。冻存应选择细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。

2、冻存盒问题：放在-80度的冻存盒异丙醇不足或未恢复至室温，冻存的原则：慢冻！

3、-80度冰箱冻存：放在－80度冰箱的时间超过半年，若冰箱温度不稳定，开门/关门，电压不稳等，反复长时间开启。因此，需要液氮同时冻存备份。液氮储存要保证细胞全部浸在液面下。