单基因玩不转？ 传授你4分+两个基因交互作用的研究套路！

今天小编要解读的这篇文章是2019年发表在Epigenetics杂志上的文章（影响因子4.173），题目是EGLN2 DNA methylation and expression interact with HIF1A to affect survival of early-stage NSCLC。

肿瘤细胞的快速增殖形成局部缺氧微环境。缺氧抑制脯氨酸羟化酶活化，使得缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)的2个脯氨酸残基无法羟基化，而在细胞内蓄积。表达增强的HIF-1α能够影响下游多个基因表达，调节血管与红细胞生成、能量代谢、细胞凋亡等活动，以维持肿瘤细胞内环境的稳定。作者采用加权随机森林(weighted random forest)，在控制协变量的基础上，对EGLN基因家族进行降维分析，识别出早期肺腺癌预后相关的DNA甲基化位点：cg25923056。进一步研究发现：编码脯氨酸羟化酶EGLN2 基因的cg25923056位点高甲基化能够抑制EGLN2的基因表达，强化HIF1A的基因表达。并且，两个基因存在交互作用。即EGLN2的表达量越低，HIF1A高表达所致肺腺癌死亡的危害效应则越高。EGLN2低表达者是高危死亡人群。降低cg25923056 EGLN2甲基化则是潜在的药物靶标。

摘要

缺氧在人类癌症中经常发生，并促进缺氧诱导因子（HIF）的稳定和激活。HIF-1α对缺氧反应具有特异性，其降解由三种酶EGLN1，EGLN2和EGLN3介导。尽管已发现EGLNs的表达与许多癌症的预后有关，但很少有研究说明EGLNs的DNA甲基化与早期非小细胞肺癌（NSCLC）预后的关系。作者分析了1230例早期NSCLC患者的肿瘤组织样本中的EGLNs DNA甲基化数据以及TCGA数据库的基因表达数据。在发现阶段和验证阶段，分别使用滑动窗口顺序前向特征选择方法和加权随机森林筛选出肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌患者的候选CpG探针。然后进行Cox回归以评估DNA甲基化与生存之间的关联。在EGLNs中的34个CpG探针中，cg25923056 EGLN2的DNA甲基化被确定与LUAD存活率显著相关，并与EGLN2表达相关。同时，EGLN2表达与肿瘤组织中HIF1A表达呈负相关，并且在整体生存率上与HIF1A表达显著相关。因此，EGLN2- HIF1A的DNA甲基化是LUAD预后的潜在标志物，这些基因是在肺癌治疗中进一步开发HIF-1α抑制剂的潜在治疗靶标。

文章流程图

结果简述

分析中包括位于EGLN基因家族成员中的34个CpG探针。在肺腺癌（LUAD）患者中，滑动窗口顺序前进特征选择（SWSFS）算法分别在发现阶段和验证阶段确定了前8个和10个CpG探针。如下图a、b所示。两个探针cg25923056和cg08080060同时在两个阶段的top列表中，如下图c、d所示。

同时，在肺鳞状细胞癌（LUSC）患者中也识别出cg07040244和cg08078058两个位点。通过Cox回归进一步评估了这四个CpG探针。经过多次测试校正后，两个阶段中只有探针cg25923056 EGLN2与LUAD患者的生存率显著相关，并且在组合集中显示出更强的关联性。 因此，以下分析仅在LUAD患者中进行。

为了更好地说明DNA甲基化对总体生存的影响，根据中位值将患者分为高低甲基化水平组。下图显示了cg25923056 EGLN2高甲基化和低甲基化的组合患者的Kaplan-Meier生存曲线。

为了同时考虑变量的线性和非线性影响并有效地处理变量之间的复杂交互作用，基于树的方法RPART提供了一种有吸引力的Cox模型替代方法。在LUAD患者中，cg25923056 EGLN2和协变量用于在组合数据集中构建生存分类树。如下图a所示。

确定了四个簇，其存活曲线（下图b）和死亡率（下图c）明显不同。探针cg25923056 EGLN2被确定为与LUAD存活相关的第二重要预测因子，仅次于分期。该模型显示，与低甲基化组相比，I期患者cg25923056 EGLN2的高甲基化与较差的生存率相关。

有趣的是，与邻近的正常组织相比，cg25923056 EGLN2在肿瘤组织中明显超甲基化。如下图a所示。同时，与邻近的正常组织相比，EGLN2在肿瘤组织中显著下调，如下图b所示。并且cg25923056 EGLN2的DNA甲基化与EGLN2基因表达负相关，如下图c所示。此外，ENGL2表达水平与其在肿瘤组织中的下游基因HIF1A表达负相关（如下图e所示），在肿瘤组织中也是差异表达的（如下图d所示）。通过按中位HIF1A表达量将患者二等分，HIF1A高表达患者的预后要比低表达组低。但是，EGLN2与HIF1A表达对患者预后有显著的交互作用（P = 0.037）。如下图f所示，随着EGLN2表达的降低，HIF1A表达对LUAD生存的影响增加。另一方面，EGLN2过度表达的患者在HIF1A表达与总生存率之间没有统计学意义。作者还评估了cg25923056 EGLN2对具有不同人口统计学和临床变量的亚组患者LUAD存活的影响。除了一些样本量较小的亚组外，几乎所有这些关联仍然很显著。

本文使用生物信息学方法，识别出早期肺腺癌预后相关的DNA甲基化位点：cg25923056。进一步研究编码脯氨酸羟化酶EGLN2 基因的cg25923056位点高甲基化能够抑制EGLN2的基因表达，强化HIF1A的基因表达。并且，两个基因存在交互作用。并最终得出结论，降低cg25923056 EGLN2甲基化可能是潜在的药物靶标。本文思路清晰，可能为非小细胞肺癌的治疗提供理论基础。