芒果实验室，293细胞培养

HEK293T细胞由HEK293细胞衍生而来，含有SV40 large T抗原，贴壁不牢。293T细胞表达 E1A蛋白，S40大T抗原，含有S40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。293T细胞容易转染，用磷酸钙、PEI或脂质体转染，效率均可达90%以上。

The 293T cell line was created in the laboratory of Michele Calos by transfection of a sub-line of adenovirus-immortalized human embryonic kidney cells with a gene encoding the SV40 T-antigen and a neomycin resistance gene. The cell line is competent for replication of vectors carrying the SV40 origin of replication. The line also has favorable tissue culture, transfection, DNA replication, gene expression, and protein production properties. It gives high titers when used to produce many viral vectors such as retroviruses and lentiviruses.

细胞培养犹如带娃，什么时候喂奶（传代），什么时候尿尿（换液），什么时候拉臭臭（冻存），必须要规律。技巧就是，每隔两天，固定时间传代，传代的细胞量，培养基和条件要一致。这样去“驯化”细胞，细胞的状态就会越来越好。

1. 实验操作应在台面中央无菌区域，不要在边缘区域操作。用品稍靠近超净工作台背面放置，可按照（从左往右）：移液器→离心管架→枪头盒→废液桶的顺序摆放。
2. 配制培养基。基本培养基需加入胎牛血清和抗生素制备成完全培养基，才能用于细胞培养。一般加10%小牛血清或胎牛血清。青/链霉素的浓度最终各为100单位/ml。
3. 为避免污染胎牛血清、胰蛋白酶和完全培养基以及PBS需分装保存，并在细胞培养操作前做好准备工作。

细胞传代培养

（一）传代前准备：

1.超净工作台经紫外线照射，75％酒精消毒双手。

2.实验用品经75％酒精消毒后放入超净台，正确摆放。

3.从培养箱内取出细胞：镜下观察细胞状态。

（二）胰蛋白酶消化：

1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗后再小心吸出，加1000ul胰蛋白酶消化液（10cm培养皿）。

2.消化情况判断：肉眼观察细胞底部脱落，表明此时细胞消化适度。

3.加入培养液：加入2ml新鲜培养液，用1000ul移液器吹打细胞，并转移至事先准备好的15ml离心管，1000转/分钟离心4分钟。

（三）分装培养细胞：

1. 弃上清液，加入新培养液：吸出旧培养基，加2m新鲜培养基，用1000ul移液器吹打细胞，吸放5次制成细胞悬液。

2.吹打制悬：混合均匀后，依稀释比例转移至2-3个事先加入适量培养基（5-7ml）的新培养皿/瓶中（一般可以1：5传代，必要时计数后分装）。

3.继续培养：分装后，做好标记（如细胞系、时间），放入二氧化碳培养箱继续培养。传代细胞3小时后开始贴附在瓶壁上。

4.实验完毕后，将实验用品带出超净台，紫外照射消毒。

所有操作的中心，一是无菌，二是规范/规律。细胞一定可以养好，实验也会有好的结果。这是基本功。