阻挡你前进的不一定是高山大海,而往往是鞋底一粒小小的沙粒!
细胞培养绝对是个技术活,跟智商关系不大。如果细胞没养好,不管是细胞系还是原代细胞,都说明没有掌握技巧。技术活,当然最好有师傅带入门,但是临床医生做科研,哪怕是最简单的细胞培养,也常常要自己摸索,或者是从不是那么专业、规范的师兄师姐那里学习。
细胞培养最好的老师,多是生物背景出身的专职科研人员,而不是医学背景的上级医师们。在细胞培养技术进阶到一定程度,支原体污染是一个难题,还有一个问题是细胞储存问题。
支原体污染最有可能出现问题的就是细胞传代前准备工作部分。避免支原体污染,最主要还是从无菌操作入手,定期检测支原体,定期消毒培养箱和工作台,避免多细胞交叉污染,规范操作。那么细胞冻存,问题又在哪里呢?
一是冻,尤其是最开始从4℃到-20℃的阶段。正常情况下,经过-20℃ 1h30min这一步后,冻存管内的细胞已经处于凝固状态,如果此时冻存管内还是液体,很可能是DMSO或冰箱冷冻功能出现了问题。如若遇到这种情况,不能因为时间到了,就把把液体状态的冻存管放置到液氮中,可以适当延长在-20℃环境下的冷冻时间30-60分钟,直至冻存液凝固后再放到液氮中。(来自网络)
二是存,一旦存放在-80℃或液氮,禁止反复(不要超过3次)、长时间取出(超过30秒)。
个人认为最需要注意的事项:
1、冻存时机:细胞状态不好(长过了或连续培养超过二个月)。冻存应选择细胞增殖旺盛,情况稳定,试验效果良好,复苏后两周内。
2、冻存盒问题:放在-80度的冻存盒异丙醇不足或未恢复至室温,冻存的原则:慢冻!
3、-80度冰箱冻存:放在-80度冰箱的时间超过半年,若冰箱温度不稳定,开门/关门,电压不稳等,反复长时间开启。因此,需要液氮同时冻存备份。液氮储存要保证细胞全部浸在液面下。