COVID-19患者恢复阶段的单细胞免疫图谱
今天分享的文献是2020年5月4日，在Cell Discovery杂志上在线发表题为“Immune cell profiling of COVID-19 patients in the recovery stage by single-cell sequencing” 的研究论文。
该文选取了早期恢复阶段（ERS）和晚期恢复阶段（LRS）来自10例COVID-19患者提供的70,858个细胞，以及5个健康供体（HC）的57,238个细胞绘制出COVID-19恢复阶段血液中免疫细胞亚群的高分辨率转录组图谱。并给出以下结论：
1、在COVID-19的早期恢复期（ERS），免疫反应还将持续7天以上，说明COVID-19患者出院后仍有一定的复发风险性；
2、单细胞分析显示免疫细胞的相互作用，其特征是COVID-19患者的ERS将增加CD14+、IL-1β+的单核细胞群体；
3、预测IL-1β和M-CSF可能是炎性风暴的新型候选靶基因；
4、新发现的病毒特异性BCR改变将有助于开发疫苗和抗体。
新冠肺炎现状
COVID-19已在全世界很多地方传播，目前已经造成了近43万人丧生。而近日我国国内又开始出现本土新增病例，人心惶惶之际，都希望能尽快研发出针对COVID-19的有效抗病毒药物和疫苗。COVID-19感染的症状表现为发热、干咳、疲劳、腹泻、结膜炎和肺炎，部分患者出现重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征或多器官功能衰竭。有研究表明，在COVID-19患者中已观察到免疫系统失调的现象，然而，患者的关键免疫细胞亚群及其状态的变化尚不清楚。
COVID-19患者的单细胞免疫图谱
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1. 实验设计
样本：
- 5名早期恢复阶段（ERS）病人和5名晚期恢复阶段（LRS）病人，共70,858个细胞
- 5名健康供体（HC）的57,238个细胞
测序平台：10x Genomic
分析方法：
- Cell Ranger软件（V3.1.0）用于测序数据的初始处理
- Seurat v3标准化归一化并选取高变异基因
- monocle3进行降维和聚类分析
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2. 初步细胞图谱结果
文章根据典型谱系标志物和每个簇中特异上调的其他基因的主要将PBMC划分为了三种免疫细胞，即Myeloid cells（36,442个细胞），NK and T cells（64,247）和B cells（10,177），划分marker如表格所示。
恢复期COVID-19患者血液中的NK和T，B和骨髓细胞的概况
文章通过比较患者与健康组的情况,发现COVID-19患者的骨髓细胞比例更高，但NK和T细胞的比例更低。有趣的是，与ERS患者相比，LRS患者的B细胞、NK和T细胞更多，但骨髓细胞却较少。结果表明，在COVID-19患者的外周血中，髓样细胞增加，而NK和T细胞减少，并且ERS和LRS患者之间的免疫细胞组成有所不同。
细胞图谱的第二次分型
文章后续又分别对三大类免疫细胞进行的更细致的划分，并对患者的状态进行了分析。
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恢复期COVID-19患者血液中的骨髓细胞亚群及其状态
1. 将骨髓细胞划分为6个亚群
2. HCs和COVID-19患者之间单核细胞亚群的差异显著
在ERS患者中，经典CD14 ++ 单核细胞（M1）的比例高于HCs，但在LRS患者中这一比例基本正常。这表明在病毒感染过程中，CD14 ++ 单核细胞的增加，促进了炎症的发生。
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恢复期COVID-19患者血液中的T细胞和NK细胞亚群及其状态
1. 将T和NK细胞划分为10个亚群
T细胞和NK细胞在呼吸道感染期间的病毒清除中起关键作用，聚类分析将T和NK淋巴细胞分为10个子集。
2. T细胞和NK细胞亚群的组成存在显著差异
相比于HCs，COVID-19患者中CD4 + T细胞相关的抗炎基因下调，这表明CD4 + T细胞是病毒感染的主要参与者；COVID-19患者中CD8 + T细胞的比例降低，暗示了CD48+ T细胞的病毒清除作用
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COVID-19患者的单细胞B细胞特征
1. 将B细胞划分为4个亚群
通过diffusion maps预测B细胞的基因表达数据，文章鉴定了四个B细胞簇。
2. B细胞亚群的组成存在显著差异
与HCs相比，COVID-19患者的浆细胞百分比显着增加，而COVID-19患者的Naive B细胞百分比显着降低。记忆B细胞和浆细胞（MPB）可能在控制病毒感染和过继免疫的发展中起重要作用。ERS和HCs之间的基因差异表明COVID-19患者的B细胞反应和抗体分泌增强。
单细胞BCR-seq分析表明，COVID-19患者的血清中IgA水平升高。并且ERS患者中（IgA + IgG + IgE）与（IgD + IgM）的比例显着增加，并且随着恢复时间呈下降趋势。
在COVID-19患者中观察到的BCR克隆扩增情况和VDJ基因表达偏好
使用sc-BCR-seq评估患者血液中克隆扩增的状态，研究者发现与HCs相比，患者中始终保持较高的B细胞克隆性。并且在ERS中尤为显著。这表明B细胞在SARS-CoV-2感染下经历独特的VDJ克隆重排。在LRS患者中，随着时间的推移，扩增的B细胞的差异基因显着降低
接下来为了研究COVID-19患者中BCR的独特变化和偏好基因，文章比较了COVID-19患者和HCs中VDJ基因的使用情况。发现与HCs相比，COVID-19患者中IGHV3家族的占比最高，尤其是IGHV3-7、IGHV3-15、IGHV3-21、IGHV3-23和IGHV3-30。
总之，COVID-19患者中B细胞的克隆性增加（主要由IgA和IgM同种型决定）以及IGHV基因的表达偏好提示了SARS-CoV-2引发疾病的作用。值得注意的是，COVID-19患者中IGV基因（尤其是IGHV3-23和IGHV3-7）的表达偏好为设计疫苗提供了框架。
COVID-19患者免疫细胞之间的Cell-to-cell communication
通过已经发表细胞-细胞相互作用分析（10.1016 / j.celrep.2018.10.047(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7009724/)）预测细胞间的相互作用。细胞-细胞相互作用分析是基于免疫相关受体和配体的表达。通过计算一种细胞类型中配体的平均表达水平与另一种细胞类型中相应的受体的平均表达水平的乘积，估算由特定配体-受体对儿介导的两种细胞之间的潜在相互作用。
结果表明在COVID-19患者中，通过B细胞-单核细胞和B细胞-T细胞的相互作用，B细胞可以分泌大量IL-6、LTA和LTB，并与在单核细胞中表达的IL-6R、LTAR和LTBR结合，和大量的IL-6作用于T细胞以促进IFN-γ、IL-1β以及其它炎性细胞因子和趋化因子的分泌。因此，在ERS COVID-19患者的病发高峰时期，会出现高表达IL-6及其后代的炎性单核细胞，并有级联反应。
这些活化的免疫细胞可能大量进入肺和其他器官的循环，并发挥免疫破坏作用。在LRS COVID-19患者中，DC可能产生IL-18，TNFSF13和TNFSF13B来促进B细胞的增殖，然后在血液中分泌许多抗体。同时还会产生IL-7以促进T细胞的增殖。而T细胞则产生IL-2以促进B细胞的增殖和抗体产生。因此，细胞间的相互作用有助于我们理解为什么COVID-19患者表现出高单核细胞率和低淋巴细胞率，以及为什么康复患者外周血中淋巴细胞的比例逐渐增加。
总结
创新点
本研究提供了COVID-19康复患者的第一份单细胞免疫图谱，文章分析了10位患者血液中的70,858个细胞的免疫种群的复杂性，并确定了ERS患者的高炎症反应，解释了为什么有些患者出院后还会复发。
研究结果表明在COVID-19患者的恢复阶段，T细胞和B细胞克隆高度增加，表明免疫系统已逐渐恢复；并鉴定出的新型BCR，以及IGHV3家族的表达偏好性。这在COVID-19免疫疗法中具有潜在的临床实用性。
缺点
基础数据似乎不公开
只有康复患者正在进行疾病的机制
仅血液，无肺组织或肺液（BAL）等组织的数据，这对机制研究很重要
结果是描述性的，没有进一步的验证
尚不清楚结果与通常的感染后变化有何不同（例如，单核细胞与淋巴细胞之比升高是感染的一般标志）
使用的计算方法不是最新技术
方法不够详细，无法重现分析
注释不佳的数字很难得出结论
没有提供统计检验，但发现声称“significant”