欢迎大家打开本次推送~从本期推送开始,将由 ? 小编为大家整理《陈巍学基因》的笔记。
《陈巍学基因》是一系列由陈巍老师主讲的视频节目,从 15 年开始更新(视频所示部分技术并非文章发布时「2020 年」最新,本系列文章会在叙述时给予加粗标注),主要为介绍基因组学,和临床分子诊断的最新技术进展。
「接下来就让我们开始吧~」
目录
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「Next-Generation Sequencing (NGS)」,中文可译为下一代/第二代测序技术。而 illumina 公司是当今二代测序的巨鳄,其测序技术原理是用可逆终止子和荧光标记的 dNTP 来做边合成、边测序[1]的工作。
?本期节目主要介绍的就是 illumina 公司 NGS 技术的生化原理。
中文可直译为流动槽
,是一种载玻片形状大小的半导体芯片,其最新用于 HiSeq 系列等测序仪(首先应用于 HiSeq X Ten 测序仪)的实物图片如下所示:
Flowcell - illumina
我们可以看到,该芯片中的玻璃被分隔成 8 条通道,每个通道称为一个 Lane,每个 Lane 两端有允许溶液进出的小孔。
Flowcell 模式图 - illumina
在最新的Nanocell
技术中,玻璃基片上蚀刻着数十亿计的有序纳米孔,纳米孔内底部以共价键的方式种有两种互补的 DNA 引物,能使 DNA 链在纳米孔内着位,而纳米孔之间的区域没有 DNA 探针(如下图)。
Nanocell - illumina
值得注意的是,每个 Lane 的上表面和下表面都种有引物,都能产生测序数据。而在每个 Lane 的每一个面又横向分为三个扫描通道,称为 Swath。在扫描时,每条 Swath 从头到底被连续扫描,扫描到的序列称为Reads。
?注:当时与 HiSeq 2000 等测序仪配套的 Flowcell 中并无纳米孔,DNA 引物随机排列在玻璃基底上(示意图可见其间隔、分布不一)。
释义:许多的 DNA 片段,在两端接上特定的 DNA 接头(adapter)所形成的混合物(非百度重定向的cDNA
文库定义)。
特点:
制作原因:测序 DNA 来源不一,需要经过类似格式化
的过程,将 DNA 处理成方便测序仪处理的形式。
Klenow酶
在 3' 端加上一个 A 碱基。建库后DNA示意图 - illumina
其基本原理传统 PCR 扩增技术,由于两端引物固定在芯片上,扩增过程中 DNA 链呈拱桥状,故名「桥式 PCR」(bridge PCR amplification)。
动画4 - illumina
动画5~6 - illumina
动画7 - illumina
目的:得到可供测序的正向单链。
过程:
Read1
引物),开始第一次测序。荧光标记带修饰的dNTP ?叠氮基团在遇到巯基试剂(如,二巯基丙醇)时,会发生断裂,并在原来的位置留下一个羟基。而这个羟基也是碱基原本应有的。 同时,巯基试剂切断叠氮基团的效率极高,这可以保证这个反应可以多次反复地高效地进行,而不影响每步反应的得率。
释义:用来标记样本来源的已知短序列(~6bp),英文称「index」(也称「Barcode」,原理类似商场通过条形码识别商品)。
Q: 为什么要加入索引?
A: 通过标记不同样本的来源,可以在一次测序流程中测出多组 DNA。
根据前面的讲解我们可以知道,一条 DNA 链,除了从 5'→3'正向读一遍,还可以从 DNA 的 3'→5'反向再读一遍。
双端测序示意图 - illumina
处理原理对比 - illumina
每条测序链都可成为一个簇,而一条芯片上有上亿个簇在同步合成、测序,能得到很大的测序量。
MPS 同时也是应用于二代和三代测序的技术基础。而关于 MPS 的更多内容我们将于后续讲解~
「 以上就是《陈巍学基因》第一期的笔记内容 ↑ 」
?教练,道理我都懂,但是测序到底怎么测啊(?)
敬请期待下期推送,我们将介绍 illumina HiSeq 2000 测序仪的原理!
[1]Sequencing-By-Synthesis(SBS): http://www.illumina.com/technology/next-generation-sequencing.html
[2]Kircher M, Sawyer S, Meyer M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic AcidsRes. 2012:2513–2524. : https://doi.org/10.1093/nar/gkr771
[3]Nakazato T, Ohta T, Bono H. Experimental design-based functional mining and characterization of high-throughput sequencing data in the sequence read archive.PLoS One. 2013;8(10):e77910.: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0077910
[4]Credit: 编辑/Andy审校/罗鹏排版由mdnice.com
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