多组学文献精读07 | TGF-β以耗竭T细胞削弱PD-L1抑制剂疗效（视频）

文章概述：

ICIs如检查点程序死亡受体 (programmed death-1,PD-1)及其配体 (PD-1 ligand,PD-L1)正在成为肿瘤另一全新突破性治疗方式。在各种类型的肿瘤中(包括尿路上皮癌)，抗PD-1/PD-L1单药的应答率差别很大。然而，仅某些患者应答非常持久。因此，更好地理解尿路上皮癌患者与PD-1/PD-L1抑制剂疗效之间的关系成为一个紧迫的主题。Mariathasan 等人对接受PD-L1抑制剂 (atezolizumab)治疗并具有临床疗效的尿路上皮癌患者进行分析。研究结果提示：CD8+效应T细胞，高TMB和新抗原负荷 (neoantigen load)水平与更好的免疫治疗疗效相关。相反，在纤维母细胞中的transforming growth factor β (TGFβ) 信号通路与更差的免疫治疗疗效相关。Mariathasan 等人进一步构建小鼠模型探究TGFβ信号通路与PD-1/PD-L1抑制剂疗效的关系。在小鼠模型中一起使用TGFβ抑制剂和PD-L1抑制剂不仅抑制了间质细胞中的TGFβ信号通路，而且促进了T细胞进入肿瘤内部，最终增强了抗肿瘤免疫力和减少了肿瘤的大小。该探究提示了TGFβ可能通过限制T细胞的浸润最终导致降低的抗肿瘤免疫力。

基本概念：

• IC：SP142对免疫细胞(IC)染色的评分-->检测PD-L1表达；分为: IC0 (<1%), IC1 (≥1% and <5%), IC2+ (≥5%).
• TC：SP142对肿瘤细胞(TC)染色的评分->检测PD-L1表达；分为: TC0; TC1; TC2+
• Response:
• PD：疾病进展（progressive disease）;
• SD：疾病稳定(stable disease);
• PR：部分缓解( partial response);
• CR：完全缓解( complete response)
• Gene set：作者手工挑选的20种基因集：例如DNA 损伤修复(DNA Damage Response and Repair, DDR)/上皮细胞-间充质转化(EMT)/TGFβ/免疫检查点相关基因/细胞周期相关基因**等。
• 新抗原负荷:肿瘤细胞突变基因编码的新生抗原，主要由基因点突变、删除突变、基因融合等产生的与正常细胞表达的蛋白不一样的新的异常蛋白。

分析流程：

结果解读：

Figure S1a 本文各项分析中使用人数(韦恩图)

• 基因表达分析：RNA-seq
• 基因表达分析 & TMB：RNA-seq与FoundationOne数据集的交集
• 基因表达分析 & 免疫表型：RNA-seq与免疫表型数据集的交集
• 免疫表型的突变分析：FoundationOne和免疫表型的交集
• TMB或基因突变状态：FoundationOne数据集

Figure 1a PD-L1在免疫细胞上的表达与反应显著有关。 检验：Fisher’s exact test

Figure S1b PD-L1在肿瘤细胞上的表达与反应无关

Figure S1c-d PD-L1在免疫细胞上的表达与免疫相关转录组特征有关，例如高CD8+T细胞Score和免疫相关基因的表达量(火山图)

Figure 1b-c 高CD8+T细胞Score具有更好的临床反应 高CD8+T细胞Score具有显著延长的OS

Figure 1d-e 高TMB具有更好的临床反应 高TMB具有具有显著延长的OS

Figure S1e-f TNB：新抗原负荷 高TNB具有更好的临床反应 高TNB具有具有显著延长的OS

Figure S1g GSEA分析(KEGG)-高TMB组 vs 低TMB组：高TMB组在细胞周期，DNA复制和DNA损伤等相关通路显著富集

Figure S1h 相关性热图分析：计算各通路分数之间的相关系数R并展示。 增殖Markers-MKI67与大多数Pathways呈正相关。

Figure S1i-j 背景知识：APOBEC3A+APOBEC3B：编码胞苷脱氧酶-->其他Cancer和泌尿系统↑↑ APOBEC3A/APOBEC3B表达与高TMB和更好的临床预后有关。

Figure 1f-g & Figure S1k-l 背景知识：DDR-DNA损伤修复；往往和高免疫原性相关。 具有DDR通路相关突变的肿瘤与高TMB和更好的临床预后有关。

Figure S2a GSEA分析(KEGG)：应答者 vs 非应答者；非应答者中仅仅显著富集了TGF-β这一细胞因子受体相关通路。 背景知识：持续的细胞因子信号与继发性免疫治疗耐药有关。

Figure S2b-c 免疫治疗应答者具有更高的IFNG和IFNGR1表达量。

Figure 1h-i & Figure S2d-e 免疫治疗非应答者的TGFB1的表达量更高；且高TGFB1表达组预后更差。 免疫治疗非应答者的TGFBR2的表达量更高；且高TGFBR2表达组预后更差。

小结：预先存在的T细胞免疫和高TMB与免疫治疗结果有关；而TGF-β与更差的治疗反应和临床预后有关。

Figure 2a-c a：IHC；棕色：CD8+T细胞；此图肿瘤内少CD8+T；而基质内富含CD8+T。 b：病人泌尿系统肿瘤的免疫表型可分为三种：耗竭+豁免+炎症 c：炎症型中具有良好应答者具有更高的CD8+T细胞Score f：具体展示下三种免疫表型的IHC，棕色：CD8+T细胞；

Figure 2d-e 背景知识：F-TBRS score-成纤维TGFβ反应分数 免疫豁免型中非应答者具有更高的F-TBRS score； 免疫豁免型中应答者具有更高TMB； 免疫炎症中应答者具有更高TMB

Figure 2f：在广义线性模型中使用不同自变量X组合去解释3种免疫表型Y的程度。 背景知识：给定自变量X-->计算因变量Y的预测值；解释变异程度：自变量X可以解释因变量Y的部分； 耗竭型：无论是单一X变量还是联合变量，都无法很好解释 豁免型：TBRS+TMB比单独TBRS或TMB能显著增加解释变异的程度。 炎症型：Teff+TMB比单独Teff能显著增加解释变异的程度。

Figure S2g 相比一种或两种核心通路，三种核心通路能够显著增加解释变异的程度。

Figure 3 Lund分型中genomically unstable(GU)组具有更高的TMB；且与免疫治疗应答有关(CR+PR比例更高)

Figure S4a-b TCGA分型中 luminal II型具有更高TMB水平

Figure S4c Lund分型中GU组具有更高TMB TCGA分型中 luminal II型具有更高TMB水平 38个在2种分型(均基因组不稳定)同时出现。 Figure S4d-e GU only组与CD8+效应细胞分数呈负相关，但却有最好的临床反应。 相反，luminal II型与F-TBRS score呈正相关，但却有最差的临床反应。

作者假设：在免疫耗竭型肿瘤中：肿瘤间质屏障-->T细胞的物理耗竭-->免疫应答差

进行试验：在EMT6小鼠模型，探究TGF-β活化间质在免疫耗竭中是否发挥着关键的作用。

Figure S5a-d EMT6小鼠模型：呈现出免疫耗竭的表型 背景知识：PDGFRa：成纤维细胞标志物；CD3+：T细胞标志物；DAPI：染色原料；Collagen：胶原

Figure S5e-f EMT6小鼠模型表达TGFβ所有亚型和PD-L1(基因和Pr水平)

Figure 4a-b & Figure 5g-h EMT6小鼠模型：单独阻断PD-L1或TGFβ；抑制肿瘤效果不佳；但是PD-L1和TGFβ联合抑制，能够明显抑制肿瘤生长，提高免疫反应效果。

Figure S5i EMT6小鼠模型中应用PD-L1和TGFβ联合抑制的反应效果很大程度上取决于CD8+T细胞是否耗竭

Figure S5i-n 重复验证上述结果：MC38小鼠模型

Figure S6a EMT6小鼠模型：应用PD-L1和TGFβ联合抑制-->增加T细胞数目

Figure 4c-d EMT6小鼠模型：FCM检测：应用PD-L1和TGFβ联合抑制-->CD8+T细胞及颗粒酶B数量显著增加

Figure S6b EMT6小鼠模型：RNA-seq数据: 应用PD-L1和TGFβ联合抑制-->IFNG，GZMB，ZAP70等相关基因表达量显著增加

Figure S6c-e EMT6小鼠模型：FCM检测：应用PD-L1和TGFβ联合抑制-->CD4+T细胞数目显著增加；Treg无明显变化 EMT6小鼠模型：RNA-seq数据: 应用PD-L1和TGFβ联合抑制-->Helios和Foxp3等基因表达量无明显变化

Figure 4e-f EMT6小鼠模型：RNA-seq数据: 应用PD-L1和TGFβ联合抑制-->CD8+Teff Score显著增加 EMT6小鼠模型：IHC：应用PD-L1和TGFβ联合抑制-->距离外周CD3+标志物著增加

Figure 4g-h g: 肿瘤外周 h:肿瘤中心 应用PD-L1和TGFβ联合抑制 比 单一疗法 能够明显增加CD3 T细胞在肿瘤外周和肿瘤中心的浸润。

Figure S6g-h 应用TGFβ抑制剂能够明显降低TGFβ通路活性，表现为SMAD2/3的磷酸化水平降低。

Figure S6i 应用TGFβ抑制剂能够降低EMT通路活性，但联合应用TGFβ和PD-L1抑制剂并没有明显降低EMT通路活性。

Figure 4i-l 联合应用TGFβ和PD-L1抑制剂-->F-TBRS score和成纤维细胞相关基因的表达量明显降低。