差异分析01，PCR/RT-PCR实战
生信论文的套路
- ONCOMINE从全景、亚型两个维度做表达差异分析；
- 临床标本从蛋白水平确认（或HPA数据库），很重要；
- Kaplan-Meier Plotter从临床意义的角度阐明其重要性；
- cBio-portal数据库做基因组学的分析（机制一）；
- STRING互作和GO/KEGG分析探讨可能的信号通路（机制二）；
- TISIDB/TIMER分析肿瘤免疫特征（机制三）。
在芯片、测序和组学等遍地开花的时代，前人已经积累了大量数据，而且信息是公开的、免费的。因此，如果我们用别人的数据发表自己的论文，从海量数据中挖掘点自己需要的东西，岂不是件很赚的事情。
具体到医学生物科研，生信分析越来越成为科研工作者必备的技能。我觉得生信分析的大方向可以分为三个：差异分析，功能分析和临床意义探索。
差异分析是所有研究的前提，无论是细胞实验、动物模型，还是临床标本，有差异都是必须的，而且我们还给差异规定了标准，p<0.05（或者更小）。目前，很多数据库可以做差异分析，从mRNA、protein到DNA都有。因为蛋白是功能的执行者，因此是做差异分析的首选。
oncomine数据库总结几乎所有肿瘤的数据，mRNA水平研究差异。全景式观察某基因在所有肿瘤的表达情况。GEPIA、UALCAN可进一步验证表达差异，数据可视化，简单方便易上手，mRNA水平研究差异。TIMER数据库对单基因的差异分析，尤其是与肿瘤浸润免疫细胞表型相关的分析，特别适用，可以做到统筹兼顾，有局部聚焦（oncomine）和全局通览（TIMER）的神奇效果。不过，在做多基因或者家族基因分析的时候，是选择oncomine+GEPIA双验证模式，而是选择oncomine+TIMER双验证，可以具体问题具体分析。
转录水平的验证，首选PCR/RT-PCT；蛋白水平的验证，首选Western Blot。我们先介绍转录水平的验证。
-------------PCR技术(Polymerase chain reaction)-------------
模板、引物和四种dNTP存在下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。
反应分三步：
变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA。
退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘- 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，反复进行。
PCR一般以cDNA或质粒为模板，但是有时会以基因组为模板，比如小鼠基因型鉴定和基因编辑效果验证。
在做genotyping或者基因编辑时，我们需要用真核细胞的基因组做PCR，那么，提取质粒的试剂盒可以用来提取细胞基因组吗？这是我最近才完全搞明确的事情。
肯定是不行的，因为原理不同。质粒提取试剂盒获得的是大肠杆菌基因组以外的DNA，也就是质粒。其原理一般是碱变性提取质粒DNA。碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
使用质粒抽提试剂盒，恰恰是把基因组去除了。
----------------------逆转录酶和RT-PCR---------------------
我们在验证肿瘤组织与正常对照转录水平差异时，是从mRNA角度去检测差异表达的，并不是从基因组DNA角度去做的。因此，依据中心法则和PCR原理，首先要完成RNA→DNA的逆转录。
RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经逆转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。实验步骤包括RNA提取；逆转录合成cDNA；PCR扩增；产物电泳和结果测定。
逆转录酶是存在于RNA病毒的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：
(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；
(2)RNA水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；
(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的cDNA。
具体操作网上有很多介绍，但是实施过程中有很多讲究，这里很难一一道明，若有机会，芒果一定录制视频，跟果友们分享。关键就是做好protocol，每一步确认，用最少的步骤完成。
分子实验，每一步都是关键，因为PCR反应是指数扩增的，一倍的误差，可能是千倍的差别。
大致流程如下（分享自lab易公众号）。
