缺氧结合免疫微环境如何打造4分+纯生信文章？

大家好！今天跟大家分享的是2020年5月发表在Frontiers in Oncology（IF = 4.848）上的文章。文章利用TCGA及CGGA数据库中胶质瘤病人表达谱数据进行低氧相关基因表达分析，基于CGGA数据集通过Cox回归分析建立模型，通过TCGA数据进行模型验证，先后利用生存曲线分析，ROC曲线分析，GSEA分析和相关性分析等方法，阐述了低氧风险模型与神经胶质瘤的预后、临床指标和免疫微环境的关系。

题目：Characterization of Hypoxia Signature to Evaluate the Tumor Immune Microenvironment and Predict Prognosis in Glioma Groups

以低氧信号的表征评估胶质瘤的肿瘤免疫微环境并预测预后

摘要

胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，包括低级别神经胶质瘤（LGG）和多形胶质母细胞瘤（GBM）。恶性神经胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤，与预后不良有关。低氧是神经胶质瘤类恶性表型的驱动因素。它会触发一系列的免疫抑制过程和恶性细胞反应（肿瘤进展，抗凋亡和对放化疗的耐药性），从而导致疾病进展以及不良预后，但确定肿瘤微环境中低氧程度的方法有待探索。

本文从CGGA（Chinese Glioma Genome Atlas）及TCGA（The Cancer Genome Atlas ）获取胶质瘤病人的RNA测序数据和临床病理数据。开发了一种低氧风险模型来反映神经胶质瘤的免疫微环境并预测预后。高风险评分与不良预后相关，并存在免疫抑制性微环境。低氧信号与临床和分子特征显著相关，可以作为神经胶质瘤病人的独立预后因素。基因集富集分析表明高风险评分组中显著富集基因集参与了癌变和免疫抑制信号传导。

综上所述，本文开发并验证了低氧风险模型，该模型可作为独立的预后指标，并可反映神经胶质瘤微环境中的整体免疫反应强度。

流程图

1. 数据的获取和整理

从CGGA下载了575名LGG病人和354名GBM病人的转录组数据和相应的临床病理信息作为训练数据集；从TCGA下载了530名LGG病人和167名GBM病人作为验证数据集。

2. 低氧信号的表征可预测脑胶质瘤的预后

从GSEA中下载与低氧相关的基因集，其中包含200个因低氧水平而上调的基因。为了了解这些与低氧相关基因之间的交互作用，使用STRING在线数据库和Cytoscape软件进行了蛋白质相互作用网络分析（图1A）。确定了交互作用程度最高的20个基因，包括GPI、ALDOA、ENO1、JUN、EGFR、PYGM、H2K、GAPDH、VEGFA、LDHA、FOS、GCK、HK1、PFKL、TPI1、PGK1、PGM1、PKR、PFKP和IL6，说明这些基因在响应低氧环境中起重要作用。

为了建立低氧风险模型来预测神经胶质瘤患者的预后，使用CGGA训练数据集对前20个基因进行单变量和多变量Cox回归分析。在单变量Cox分析中，有20个与低氧相关基因与患者的总体生存率（OS）显著相关。在多变量Cox分析中，发现了5个低氧相关基因（VEGFA、HK2、JUN、LDHA和GAPDH），以这5个基因来构建预测模型（图1B）。制定了风险评分公式，如下所示，在CGGA（图1C）和TCGA（图1D）数据集中，发现5个基因均具有显著相关性。

3. 低氧风险模型对于评价胶质瘤类预后的价值

低氧通常会促进更恶性的肿瘤表型，因此文章进一步研究了低氧信号的预后价值。如热图所示（图2A），随着CGGA和TCGA数据中风险评分的增加，5个低氧相关基因的表达增加，这意味着高风险患者倾向于发展低氧微环境。数据显示，高风险组的死亡率显著高于低风险组（图2B，C）。利用生存曲线评估神经胶质瘤中低氧信号的预后价值，如图2C所示，高低氧风险评分与CGGA数据中较差的OS相关，TCGA数据中也有同样结果（图2D）。

文章还研究了低氧风险模型对于预测不同WHO分级胶质瘤预后的价值。结果显示，在CGGA和TCGA数据的LGG患者中，高风险评分患者的OS明显短于低评分患者（图2E，F）。在GBM患者中，CGGA数据中高风险评分患者的OS较差，而TCGA数据中则无显著差异（图2G，H）（p = 0.07）。

4. 低氧基因表达与胶质瘤的临床病理特征相关

低氧微环境对于肿瘤的发生发展具有重要生物学功能，文章系统地研究了5个已鉴定的低氧基因与神经胶质瘤病理特征之间的关系，其中包括WHO分级，IDH状况和1p / 19q共丢失状况。基因表达水平和WHO分级以热图显示（图3A，B），表明在WHO高等级中基因表达显著增加。

CGGA（图3C）和TCGA数据（图3D）中的定量分析也证实了WHO分级与表达水平之间的显著相关性。随着WHO等级的提高，这5个基因的表达水平也随之升高。

文章分别研究了基因表达与1p / 19q共丢失状态和IDH状态的关系。结果显示，在具有野生型IDH（图3E）和野生型1p / 19q编码（图3F）的神经胶质瘤中，5个基因的表达水平显著较高。

5. 低氧风险模型具有强大的预后评估能力

为了评估低氧风险模型对于1年、3年和5年生存率的预测效率，文章利用CGGA数据进行ROC曲线分析，表明其具有较高的预测能力（图4A）。TCGA数据集也进一步验证了该结果（图4B）。

高风险评分的患者可能会出现低氧肿瘤微环境。高风险分数和低风险分数的标准是根据与Youden指数区分的（源自生存率的AUROC）。风险模型的临界值为14.4，将患者分为高风险组（风险评分≥14.4）和低风险组（风险评分<14.4）。高风险组（风险评分≥14.4）的患者与较差OS有关。

然后将单因素和多因素Cox分析用于评估神经胶质瘤患者OS的低氧风险信号的独立预后价值。单因素分析表明，高低氧风险评分与不良OS显著相关（图4C）。其他变量与不良生存相关的因素包括年龄，WHO等级，IDH状况和1p19q共丢失状况。多变量分析表明，高风险评分与神经胶质瘤患者的显著较差OS有关（图4D），可以作为神经胶质瘤的独立预后指标。TCGA数据库也得到了相似的结果（图4E，F）。

6. GSEA鉴定低氧相关的信号通路

为了进一步验证在高风险组中激活的相关信号通路，利用GSEA比较高风险组和低风险组。在CGGA数据中，高风险组的基因富集在刺激肿瘤增殖和抗凋亡有关的生物学过程中，例如低氧、DNA修复、PI3K-AKT-MTOR信号传导和血管生成（图5A），在TCGA数据中也得到了类似的结果（图5B）。

7. 低风险组与高风险组脑胶质瘤患者之间的免疫状况

低氧微环境可能会通过抑制抗肿瘤免疫效应细胞并促进免疫逃逸来保护肿瘤免受自然抗肿瘤免疫反应。文章分析了低氧风险模型评估免疫微环境的能力。

使用CIBERSORT方法与LM22特征矩阵相结合，文章评估了低风险和高风险神经胶质瘤患者22种免疫细胞类型的免疫浸润差异。图6A总结两个数据库的结果。高风险患者的免疫抑制细胞（Tregs、TAM和中性粒细胞）（图6B–D），静息T细胞和NK细胞（图6E，F）的比例明显较高，但活化的NK的比例明显较低（图6G）。尽管高风险组和低风险组之间的CD8 + T细胞没有差异，但免疫抑制细胞和未活化的NK细胞可能会导致免疫抑制微环境。

接下来，文章分析了与低氧基因特征相关的免疫相关生物学过程。对高风险组样本和低风险组样本进行GSEA分析，高风险组胶质瘤表达谱明显在免疫途径的负调控中富集，例如B细胞的负调控、CD4+αβ细胞活化，αβ T细胞活化和T细胞分化（图6H）。靶向低氧基因可能对改善免疫治疗具有重要的临床意义。

8. 高风险评分肿瘤预示会产生免疫抑制微环境

本文分析了低和高风险组中负调控肿瘤免疫循环基因表达的情况。基因特征可从追踪肿瘤免疫表型网站下载。如图7A，B所示，在高风险评分组中，与肿瘤免疫循环负调控有关的基因大部分被上调，表明该组患者肿瘤免疫循环过程呈现低活性。

前期结果表明，低氧环境可以降低免疫抑制细胞因子和免疫检查点的表达。高风险评分组中PD1和PD-L1的表达被上调（图7C-F）。此外，高风险评分组中关键免疫检查点基因（CTLA-4和LAG-3）的表达明显高于低氧风险组（图7G，H），免疫抑制细胞因子也明显上调表达（图7I，J）。这些结果表明，高风险患者倾向于通过上调免疫抑制细胞因子和免疫检查点基因形成免疫抑制微环境。

结语

本文从利用公共数据库中胶质瘤病人的RNA测序数据和临床病理数据，开发了一种低氧风险模型来反映神经胶质瘤的免疫微环境并预测癌症预后。文章将低氧基因与癌症预后联系起来，得到了很好的预测结果。

本文的一大亮点为专门设置了训练数据集与验证数据集，所有结果均为先训练，后验证，具有较强说服力。另一亮点为本文分析较为细致，联合分析了临床上的各种指标，而且将低氧基因与免疫微环境联系在一起，内容丰富。不足之处是分析内容过于分散，导致主线思路不清晰，除此之外文章细节上有待加强，有些许小错误。