如何看待IHC实验的抗原修复环节？

Mark Chen

发布于 2020-07-20 16:00:34

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发布于 2020-07-20 16:00:34

文章被收录于专栏：聊点学术聊点学术

“ 抗原修复是IHC的成败关键。”

在以前的推文中，小编已经把免疫组化(IHC)的实验步骤、细节、常见问题以及IHC图像分析都介绍了(详见往期内容)。IHC实验的大致框架基本完成。

今天，小编想就IHC实验中抗原修复环节聊聊，因为这个环节太重要了，不得不详细说明。此外，小编还想给大家推荐一个专业的网站，供大家日常学习和参考。

This is the dividing line.

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抗原修复的重要性

抗原修复为什么这么重要呢？

首先，由于甲醛固定导致组织上很多抗原的免疫活性丢失，无法直接标记染色。为了更好地恢复这些抗原的活性，我们必须要进行抗原修复这一步。

其次，在IHC实验中，我们使用的抗体是要与组织上的抗原直接结合的。如果抗原修复在这一步出了问题，实验下游所有操作基本等于白做，结果的假阴性率极高。

第三，目前抗原修复所使用的试剂、步骤存在一定的混乱。如何才能更好地修复抗原，成为一个必须解释的问题。

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抗原修复的技术

抗原修复的技术过程，归结起来就一句话。

甲醛固定、石蜡包埋的组织抗原，在水溶性介质中随着加热时间的变化而出现的变化。

一定时间的加热处理是抗原修复的根本因素。效率最高的是高压抗原修复。

步骤：

（1）切片常规脱蜡入水

（2）去离子水漂洗3min*3次

（3）切片置于科研用高压锅中高温高压处理约10分钟。具体就是切片置于切片架子上，切片应该被淹没在高压锅内液面以下，待高压锅喷气后（约6分钟），再维持4分钟，具体需根据自己的实验进行适当摸索。

（4）连同热的修复液一起取出切片，自然恢复至室温后，去离子水漂洗3min*3次。

（5）PBS漂洗，平衡切片上组织的PH值，继续进行后续试验即可。

为什么小编推荐采用高压锅修复呢？因为高压锅修复的条件稳定，修复温度高(蒸汽比水的温度高)、容易控制、修复时间较短，这是其他修复方法达不到的。唯一能媲美的就是微波修复法，但微波修复温度不易控制，很容易修复不完全导致假阴性。

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抗原修复的原理

甲醛固定后，组织抗原到底发生了什么？

研究显示，10%多聚甲醛固定后，可导致持续的氨基交联和蛋白三级结构变化，尤其是蛋白分子苯环结构的位置会发生变化，这些变化均会导致抗原决定簇位点发生改变。长时间的固定对于抗原是有害的。这些抗原在高温加热时能一定程度地恢复其抗原活性。

加热对于甲醛固定和石蜡包埋的组织具有重要的修复作用。但是无论如何，由甲醛固定所造成的分子交联肯定不能100%被修复。我们要做的就是尽可能更好地修复这些抗原，并在接下来的实验中维持其活性。

尽管市面上有很多种类的抗原修复液可供使用，例如PH为2、4、6、8、10等等不同PH的试剂。目前常用的是PH6.0的枸橼酸钠、PH8.0的EDTA。

PH6.0的枸橼酸钠修复液可以扩张细胞膜及核膜的膜孔，增大膜的通透性，细胞核或者一部分的细胞质抗原使用PH6.0的枸橼酸钠是比较合适的。

PH8.0的EDTA本身是一种螯合剂，可以较好地消除甲醛固定后的不利因素，比较适合胞膜和大部分的细胞质抗原。这一点可以从侧面反映。大家都知道，骨组织在固定后需要脱钙处理才能制作切片。进行科研实验时，脱钙液常选用高PH的EDTA，因为它是一种螯合剂，可以比较温和地将组织中的钙置换出来，从而达到脱钙目的，对组织损伤较小。

综合来看，对于较难处理的抗原，如细胞核抗原，我们要选择更激烈的PH6.0枸橼酸钠+高温高压抗原修复法，而比较容易修复的胞质抗原则可考虑使用温和的微波+EDTA法修复。

有些朋友可能会提到“消化酶处理法”。诚然，消化酶确实对一部分抗原有修复效果，但是注意了，消化酶对相当一部分的抗原修复效果较差甚至没有修复作用，例如消化酶可对S-100蛋白、波纹蛋白等就没有修复作用。因此，就适用范围来讲，它不是最好的选择。

就修复液的组成来说，PH的高低甚至比修复液所包含的化学成分还要重要。而就整个抗原修复条件来看，加热温度和加热时间是决定性因素。没有任何一种修复液和修复条件是普适性的，至少目前没有。否则就不叫科研了。你才是最懂自己实验的专家。

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病理实验网站

long long ago，小编发现了一个有趣的病理实验网站。

网址如下：

http://www.ihcworld.com/protocol_database.htm

网站界面如下：