Co-IP免疫共沉淀

“ 此文回应小伙伴关于Co-IP的咨询。”

日常科研中，我们常需要研究多个蛋白（例如蛋白A、B、C）在细胞内的相互作用，会尝试解释其A、B、C上下游关系，那么必然需要涉及一个问题，即这3个蛋白是否能够互相结合。

对于已经研究成熟的蛋白而言，它们之间的相互作用是已确定的，所以蛋白之间能否相互作用这个问题被弱化了。可是，当我们需要探索蛋白D和蛋白E之间未知的作用及可能存在的调控关系时，则必须要证明在生理情况下蛋白D和蛋白E能否互相结合，这是大前提。

在写免疫共沉淀（即Co-IP，Co-Immunoprecipitation）之前，首先得了解一下免疫沉淀（即IP，Immunoprecipitation）。

IP与Co-IP的原理都是借助抗原-抗体之间的专一性作用，形成抗原-抗体复合物，以此为基础研究蛋白质的经典方法。从下面的流程图就能看出，Co-IP和IP的实验过程很类似，Co-IP是对IP的具体应用，二者还是有区别的。

IP是为了通过免疫沉淀，获得单个蛋白分子。

(IP流程，图片来自网络)

Co-IP 是通过免疫沉淀获得已知的蛋白及其互相作用的蛋白，以确定这两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的方法。

(Co-IP流程，图片来自网络)

有了上面的铺垫，更方便推出今天的主角，Co-IP。

设想一下。

例如，我们要研究蛋白X和蛋白Y之间是否存在相互作用，可以使用蛋白X的特异性抗体Z去结合蛋白X，假如蛋白Y能够与蛋白X结合后相互作用，那么理论上蛋白X、Y和Z将形成一个X-Y-Z抗原抗体复合物。此时，我们再使用protein A-琼脂糖珠耦合抗体Z，离心后就能得到protein A-琼脂糖珠-X-Y-Z复合物，加入上样缓冲液之后再煮沸，可以将protein A-琼脂糖珠-X-Y-Z复合物分解为protein A、琼脂糖珠、蛋白X、蛋白Y、蛋白Z。然后再通过western blot电泳，可以在条带上显示出蛋白应该存在的位置。如果蛋白X和蛋白Y能够相互作用，那么此时应该能在条带上蛋白X和蛋白Y正确的分子量位置找到它们的条带。

(prorein A是从金黄葡萄球菌细胞壁中分离的蛋白，能特异性的结合到抗体的Fc段上，最终它可以与抗原、抗体一起形成复合物，而不影响抗原和抗体间的特异性关系。)

大致原理如上所述，接下来是原理的分述。

既然是验证生理状态下蛋白的相互作用，那么一定是在非变性条件下裂解细胞，这样可以将完整细胞内存在的蛋白质间相互作用保留下来，而我们常常进行的Western Blot是在变性条件下研究蛋白的表达水平。

如何才能将温和地释放细胞内蛋白，尽可能保证它们的原始状态呢？

注意三点即可，第一是温和地释放细胞内蛋白，第二是保证释放出的蛋白不被蛋白酶分解，第三是实验过程保持低温。

细胞裂解必须采用温和的裂解条件，而不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，一般多采用非离子变性剂如终浓度为1%的NP-40、或者破膜剂TritonX-100。严禁使用高浓度的变性剂0.2％SDS或者含去氧胆酸钠的裂解液，因为它们都属于离子型去污剂，会使蛋白变性。如果找不到适合的商用裂解液，可以尝试自己配制。

保证被释放的蛋白不被各种蛋白酶裂解是非常重要的。常规Western Blot实验时，我们会加入蛋白酶和蛋白磷酸酶抑制剂。在Co-IP实验时，我们需要尽可能地在裂解液中增加蛋白酶抑制剂的种类，并且保证现用现配，例如PMSF在溶液中30分钟即开始变性失效。

蛋白酶抑制剂可包含PMSF、EDTA、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂。蛋白磷酸酶抑制剂可包含激活的Na3VO4和NaF。使用的蛋白酶抑制种类并不是一成不变的，假如你要研究磷酸酶活性，显然不能加入磷酸酶抑制剂。

蛋白对高温或者温度变化非常敏感，因此保证实验的整个过程低温很关键，全程4℃是适合的。这需要我们将实验过程中使用的裂解液、磷酸盐缓冲液、容器、试管、离心机、protein A-琼脂糖珠等等提前预冷到4℃才能使用。细节是所有实验成功的灵魂。

值得指出的是每种细胞的裂解条件是不一样的，这需要在前期实验中充分摸索后敲定。

获得了这些细胞裂解物之后，接下来就是加入足量的抗体，4℃缓慢摇床过夜孵育，保证抗体与目标蛋白充分接触。将预处理过的protein A-琼脂糖珠加入到已经抗体孵育的细胞裂解液中再次4°C摇床孵育3h，保证抗体与protein A-琼脂糖珠耦联；免疫反应结束后，在4°C离心机作用下将整个复合物离心至管底，小心吸取上清液，这些管底的复合物用裂解缓冲液冲洗，最后加入SDS上样缓冲液煮沸，将复合物分解为单个的蛋白，即protein A、目标蛋白X和蛋白Y、目标蛋白X的抗体。然后常规Western Blot电泳即可。

如果蛋白X和蛋白Y能够相互作用，那么最终应该能在条带上按照蛋白X和蛋白Y正确的分子量位置找到它们的条带。

需要提前做的是，在最开始获取了细胞裂解物之后要留取一点样品，跑一下Western Blot，并使用蛋白X、蛋白Y各自的特异性抗体确定蛋白X和蛋白Y在条带上的位置。以此充分论证上述Co-IP实验结果。

如果需要进行目标蛋白N端测序，则在电泳后通过考马斯亮蓝染色，确定分子量，裁下电泳胶，再使用乙腈、胰蛋白酶、电洗脱、高效液相色谱分离肽等方法，最终进行Edman降解测序。

（图片来自网络，侵删）

至此，Co-IP实验基本过程已结束，接下来主要说下注意事项。

注意事项：

（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而不是外源性的非特异蛋白。

这句话的含义是，你需要保证加入的抗体本身不会形成共沉淀、保证使用正常的IGg抗体作为抗体阴性对照、保证在不表达目标抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀、保证加入的抗体只结合目标抗原（抗原-抗体强特异性）。一个有效的手段就是使用特异性好的单克隆抗体，这就需要我们提前通过WB实验摸索出好用的抗体。总之，需要根据实际情况，充分设置对照，只有这样才能斩金截铁地作出结论。

（2）需要确定蛋白间的相互作用是发生在活的细胞中，而不是由于细胞膜溶解后才发生的。

这句话的含义是如果不加入裂解液，我们加入了抗体，此时不会形成免疫共沉淀蛋复合物；同时，我们还必须通过免疫荧光双重标记做共定位分析，确定需要研究的蛋白质确实存在于细胞内，并且有共定位特征。

（3）细节，细节，细节。

Co-IP的优点是能够在天然状态下分析经翻译后修饰过的蛋白质之间的相互作用，排除了人为因素的干扰，同时还能分离这种复合物。如果整个实验论证充分，将会是一个很有力的证据。

Co-IP的缺点也很明显，对于低亲和力或者瞬间接触后分离的蛋白质相互作用，Co-IP可能无法检测。Co-IP是验证两种蛋白质结合后相互作用，假如存在多个其它蛋白在其中发挥桥接作用，Co-IP是无法有效论证这种间接关系的，简言之，Co-IP仅能分析蛋白A和蛋白B之间的一对一相互作用关系。此外，准确预测是Co-IP成功的大前提，如果前期预测和论证不充分，则可能不断的失败。有钱，另说。