单基因套路看腻了？换个套路不一样的风景

Identification of immune-enhanced molecular subtype associated with BRCA1 mutations, immune checkpoints and clinical outcome in ovarian carcinoma

与BRCA1突变，免疫检查点，临床预后相关的卵巢癌免疫增强亚型鉴定

一、研究背景

• 卵巢癌是最常见的妇科肿瘤之一，通过手术与含铂化疗方案治疗，五年生存率20%-30%。免疫治疗通过对免疫系统与免疫微环境的作用，可以提高治疗效果。
• CD86/ CD80 与 免疫检查点分子CD28/ CTLA4结合后抑制T细胞作用。因而作用于PD-1与CTLA4的免疫检查点抑制剂可以激活免疫细胞，使免疫微环境恢复正常。但对卵巢癌中免疫检查点基因表达研究不足。

二、分析流程

三、结果解读

1.基于免疫基因进行卵巢癌分型

作者通过聚类分析，将卵巢癌分为4个亚型。

• 1A:CDF曲线表明当K=4时，AUC接近最大值
• 1B:计算k与k-1的AUC变化，k=4时变化变缓
• 1C:四种亚型的一致性矩阵热图，由白色到蓝色一致性矩阵的值变大
• 1D:以FDR < 0.05为标准，各亚型中交叉的高表达基因Venn图
• 1E:取前100个高表达基因做PCA图，4个亚型聚类明显
• 1F:前100个高表达基因的热图分析，不同亚型的基因表达谱差异明显

图1.基于免疫基因的卵巢癌分型

2.四种亚型与临床特征间关系

四种亚型与年龄和肿瘤分级间的关系无统计学意义，但与肿瘤分期关系密切，其中Stage II 中的 C3 亚型显著高于C4。

表1.四种亚型与临床特征间关系

3.四种亚型与免疫间的关系

作者通过分析免疫基因表达，对肿瘤免疫微环境评分（immuneScore,StromalScore,ESTIMATEScore），对6种肿瘤浸润免疫细胞评分来分析四种亚型与免疫间的关系。

• 2A: 13个免疫基因大多在C3高表达，少数在C3与C4高表达
• 2B: C3的免疫评分高，C4的基质评分与ESTIMATE评分高
• 2C: C3的 B细胞与CD8细胞评分比其他亚型高，C3和C4中巨噬细胞，中性粒细胞，树突细胞评分比C1和C2高。总体而言，免疫微环境在C3和C4亚型中加强
• 2D: 四个亚型中28个免疫细胞基因表达评分。大多基因在C3中高表达，少数在C3和C4中高表达

图2.四种亚型与免疫间的关系

4.四个亚型中预后差异与BRCA突变差异

作者通过生存分析判断四个亚型的预后，发现同样免疫增强的C3和C4临床预后差异明显。通过 MuTect对TCGA的SNP数据进行分析，计算抑癌基因BRCA在不同亚型的突变比例，并进一步分析不同亚型的基因突变频率，发现C4基因突变频率高于其它亚型。

• 3A: 通过K-M生存分析和log-rank检验展示不同亚型的预后。C4的预后最差，C3的预后好于其他亚型
• 3B: C3与C4预后有显著差异,提示同样是免疫增强的亚型有着相反的临床结果
• 3C: BRCA1突变在四个亚型中所占比例，C3高于其它亚型，统计学差异显著 (χ2 test, P = .036)
• 3D: BRCA2突变在四个亚型中所占比例，C4高于其它亚型,但统计学差异不显著(χ2 test, P = .617)
• 3E: 四个亚型中基因突变频率，C4高于其它亚型

图3.四个亚型中预后差异与BRCA突变差异

5.8个免疫检查点基因在四个亚型中的表达

通过SNK，ANOVA检测分析不同亚型中免疫检查点基因表达。PDCD1, CD274, PDCD1LG2, CTLA4, CD86，CD80 在C3中表达显著高于其他亚型，CD267在C4中高表达。

图4.免疫检查点基因在四个亚型中的表达

6.免疫增强亚型相关模块的WGCNA分析和挖掘

作者通过WGCNA分析将相关基因分为5个模块，分析五个模块在四个亚型中的表达差异。通过KEGG通路富集分析五个模块对应通路。

• 5A/B:软阈值选择，β = 2为最佳软阈值，基因分布符合无尺度网络
• 5C: 基因被分为5个模块，不包含在任何模块中的基因放入灰色模块
• 5D: 5个模块和4种亚型间关联，C1与蓝色模块关联强，C2与蓝色模块关联弱，C3与棕色模块关联强，C4与黄色模块关联强
• 5E: KEGG通路富集分析，棕色模块42条，黄色模块30条，蓝色模块94条。121 条通路在三个模块都有富集，其中黄色模块最多

图5.免疫增强亚型相关模块的WGCNA分析和挖掘

7.使用测试集进行验证

使用GSE26193数据集中 107 个样本进行验证，预测C1有55例，C2有15例,C3有24例,C4有17例,分析免疫相关基因表达与预后，与训练集结果一致

• 6A: 四个亚型中13个免疫基因的表达
• 6B: 四个亚型免疫评分,基质评分,ESTIMATE评分
• 6C: 8个免疫检查点基因表达检测
• 6D/E: 四个亚型生存分析

图6.测试集验证

小结

作者利用TCGA-卵巢癌,GEO数据将卵巢癌分为四个亚型，并分析了免疫相关基因在四个亚型中的表达差异。其中有两个免疫增强亚型但临床预后结果相反，表明免疫增强不一定对应预后较好。作者进一步进行了BRCA突变，基因突变频率，WGCNA分析与KEGG通路富集分析，发现临床预后与突变基因种类，突变频率，通路改变都有关系

校审：糯米饭