你不知道的PBMC

指外PBMC（peripheral blood mononuclear cell，外周血单核细胞），指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞等。外周血中除单个核细胞外，还包含无核的血小板和成熟的红细胞，多核的粒细胞(granulocytes) 。

【人类PBMC的起源和衍生】

外周外周血单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞(HSCs)。造血干细胞通过造血过程生成免疫系统中的所有血细胞。造血干细胞在造血过程中产生髓系细胞(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、树突状细胞、红细胞)和淋巴系细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)。

【人类PBMC不同细胞类型的比例】

细胞PBMC细胞有圆核，包括异构的细胞群组成的各种比例的淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)，树突细胞，这些细胞和单核细胞是先天和适应性免疫系统的关键组件，是帮助身体抵御病毒，细菌，寄生虫感染，摧毁肿瘤细胞和外来物质的有力武器。

细胞PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3 T细胞又占了淋巴细胞中的绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始(naive)状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。在正常人体中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，其余的单核细胞的比例在10-30%，受到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。

【PBMC的提取方法】

密度梯度离心

优势：去除杂细胞获取目的细胞，且不会损伤细胞在下游分析中的功能；

应用：常用于分选、功能实验；

缺点：该方法耗时长，需要细致和专业的操作。

细胞此方法是利用细胞密度比重不同来分离细胞，根据研究的目的细胞群不同，常选择Ficoll和Percoll这２种淋巴细胞分离液。二者区别如下：

Ficoll：分离到的主要为PBMC，如需检测粒细胞等多形核细胞不适合选Ficoll作为细胞分离液。

Percoll：区分的密度梯度更多，几种细胞密度相差不多时，Percoll依然能分开；Percoll具有渗透性低、不穿透细胞、密度高、无毒害等方面的优势。

【提取PBMC常见问题解答】

1.人外周血单个核细胞分离后培养，有很多针尖大小的圆形细胞，是什么东西，如何去除？

可能可能是血小板。血小板密度低，主要在血浆中，吸膜层需要注意，尽量不吸到过多血浆。血浆含有血小板，影响不会很大，后面换液可去除，或者分离后细胞多洗几遍，最后低转速离心去除。

2.如何复苏可以提高单个核细胞活力？

可能复苏时最佳的条件是使用20％S-RPMI（小牛血清），预热至37度，离心力和离心时间设置为500g×10分钟，最后PBMC的孵育37度30分钟～1小时。

【PBMC的临床应用】

美国美国生物学家乔治戴利曾经说过，如果20世纪是药物治疗的时代，那么21世纪就是细胞治疗的时代。在杀伤肿瘤细胞过程中，无特定靶向作用靶点的淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC），以及有特定作用靶点的各种T淋巴细胞，如肿瘤浸润性T细胞（TIL）、T细胞受体嵌合型T细胞（TCR-T）、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T） 等均发挥重要作用。

1.淋巴因子激活的杀伤细胞——LAK免疫疗法

淋巴淋巴因子激活的杀伤细胞 (LAK) 是最早的细胞免疫治疗方法。LAK疗法是将健康人外周血单核白细胞 (PBL)在体外培养，经淋巴因子白介素2 (IL-2)激活后扩增，回输至患者体内从而广谱地杀伤肿瘤细胞（杀伤对NK细胞不敏感的肿瘤细胞）的治疗方法。该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌等疗效较显著。

2.细胞因子诱导的杀伤细胞及链式激活的免疫细胞——CIK&CAPRI免疫疗法

淋巴细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）是通过细胞因子IL-2、CD3单抗以及干扰素γ(IFN-γ) 共同诱导PBMC而获得。CIK是非主要组织相容性复合体（ MHC）限制性的杀伤细胞，在血液系统肿瘤及肝癌、肺癌等实体肿瘤的治疗中有一定的疗效。

淋巴链式激活的免疫细胞(CAPRI) 是在CIK的基础上发展而来，CAPRI主要是利用患者自身的PBMC，加入CD3单抗和IL-2激活，并在体外将初始T细胞诱导为杀伤性效应细胞。CAPRI细胞治疗的临床效果优于CIK、LAK等细胞治疗，延长了转移性乳腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤患者的生存时间。

3.体外受精治疗——PBMCs宫腔灌注

淋巴在很多不孕不育的患者在第三代试管婴儿过程中，患者的相关检查都是一切正常，但在多次移植后依然失败，失败率较高，这种情况都统一称为“原因不明”。一个全新的宫腔灌注技术近年受到了国际追捧——PBMCs外周血单个核细胞（PBMCs）宫腔灌注（抽提患者自身的PBMCs后在体外进行培养和刺激，然后在胚胎移植前灌注到患者宫腔内）。该方法应用于IVF（体外受精）治疗中的反复着床失败患者，其研究发现PBMCs灌注可有效提高着床率和妊娠率。

随后陆续有学者在人的冻胚和鲜胚移植周期、以及母牛的子宫进行了相关的研究，均得到了类似的结果。目前的临床数据显示，PBMCs治疗大幅度提高了反复着床失败患者的胚胎种植率和临床妊娠率。

参考文献

【Peripheral Blood Mononuclear Cells: A Brief Review】