单细胞测序联合CRISPR技术

研究背景

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CRISPR工具可与高分辨率表型分析相结合，实现具有丰富信息的基因筛查，提高研究复杂细胞遗传控制的能力。单细胞CRISPR筛选是将CRISPR筛选与单细胞转录组测序（scRNA-seq）相结合，探索基因功能和遗传调控网络的方法。

本文提出了一种直接捕获的Perturb-seq筛选方法，结合CRISPR技术与scRNA-seq技术，实现组合遗传扰动的单细胞分析。

研究结果

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1) 直接捕获Perturb-seq策略

Perturb-seq技术使用基于液滴的scRNA-seq。对于5’端scRNA-seq，需要添加未编码、指导特异性的RT引物。对于3’端scRNA-seq，RT配置实现需要全新的scRNA-seq平台。该平台与条形码oligo-dT一起同时提供靶标特异性条形码引物（图1）。靶标特异性引物退火以捕获修饰的sgRNA恒定区（CR）中的序列（cs1和cs2），从而实现sgRNA的RT和sgRNA序列的有效标记。

图1 直接捕获Perturb-seq策略

2) 捕获性能测试

为了测试捕获性能，作者利用K562细胞进行了基于CRISPR干扰（CRISPRi）的筛选，以比较3'直接捕获和5'直接捕获与GBC Perturb-seq的区别。在每个平台上，筛选了一个或多个包含相同32个靶向序列的sgRNA文库。这些序列靶向30种基因和2个非靶向对照。

在恒定的测序深度下，与基于GBC的方法相比，两种直接捕获平台的捕获能力更高（图a），捕获率随guides的不同而改变（图b,c）。该直接捕获Perturb-seq技术可以为84~94％的细胞可靠地分配guides（图d）。

图2 捕获性能测试

3) 使用直接捕获Perturb-seq研究遗传互作（GIs）

使用双向导载体的克隆方法克隆了一个由92个程序化sgRNA对组成的CRISPRi文库（图a）。基于胆固醇生物合成和DNA修复基因之间的GIs模型，通过3’直接捕获Perturb-seq在K562细胞中筛选CRISPRi文库，研究了胆固醇生物合成和DNA修复基因之间的GIs。

研究发现，早期通路步骤的干扰导致了胆固醇生物合成基因的上调；抑制与DNA修复相关的合成致死基因，导致细胞周期s期细胞积累（图d）；调节胆固醇生物合成的早期和中期步骤的基因之间存在缓冲关系（图e）。

图3 胆固醇生物合成和DNA修复基因之间遗传互作

4) 提高筛选效率

为了进一步实现单细胞CRISPR筛选工作，测试每个基因向同一细胞共递送了多少个sgRNAs。作者选择对单个基因具有高预测活性的成对CRISPRi和CRISPR激活（CRISPRa）sgRNAs，在K562细胞中进行直接捕获Perturb-seq。

结果显示，对于CRISPRi和CRISPRa，多路复用sgRNAs的CRISPR活性几乎是最佳单向导的两倍。最后，作者进行了基于杂交的靶标富集，对生物学上有意义的基因组进行了研究。

图4 多路复用CRISPRi/CRISPRa sgRNA文库提高筛选效率

研究结论

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1、 提出了直接捕获Perturb-seq技术，这是一种多用途的筛选方法。

2、 直接捕获Perturb-seq能够从单个细胞中检测多个不同的sgRNAs序列。

3、 验证该方法在基因相互作用的高通量研究中的实用性，解剖胆固醇生物发生和DNA修复之间的上位相互作用。

4、 使用直接捕获Perturb-seq，针对每个细胞具有多个sgRNAs的单个基因，可以提高CRISPR干扰和激活的效率，促进了紧凑、高度活跃的CRISPR文库在单细胞筛选中的使用。

参考文献

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Replogle JM, Norman TM, Xu A, et al. Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing . Nat Biotechnol.2020