对于高通量技术大家一定都不陌生,但生物信息分析之后该做什么呢?接下来的日子,小编会和大家探讨并分享高通量测序后的实验验证,即该用什么技术做什么验证!
关于实验小编也是初来乍到,今天先和大家探讨最常见的转录组测序后的验证方法。转录组的验证方法有点多(如表达量验证、亚细胞定位、RNA结合蛋白、功能获得验证、功能缺失验证等),本篇只先介绍表达量验证、RNA结合蛋白、亚细胞定位,其余的下期见!
表达量验证
qRT-PCR
设计引物RNA进行qRT-PCR。
哈哈哈,如果你和小编一样曾是生信dog,我相信你一定一脸懵逼,我连PCR到底是啥能干啥都不知道,你跟我说qRT-PCR!
小编以一个实验编外人士跟你通俗易懂的科普一下,PCR是设计引物判断某个DNA序列是否存在的技术;RT-PCR对RNA进行反转录(Reverse transcription)得到cDNA后,以cDNA为模板进行PCR反应,进而判断某个RNA序列是否存在的技术;qPCR不只判断DNA是否存在,还能判断含量高低,qRT-PCR即quatitative RT-PCR,是判断RNA是否存在以及含量高低的技术!
总结一句话,PCR都得设计引物,带RT就是研究RNA,不带RT就是研究DNA,带q就是定量,不带q就是定性!至于他是咋定量的呢,划重点,靠内参!!
小编已经快被自己总结能力所折服了!
Northern blot
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分,然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。PS: Northern blot样品需除去RNA酶。
小编再给大家科普一下下,Western Blot做蛋白,Southern Blot做DNA,Eastern blotting是Western Blot的变形也是作蛋白,不过没得到广泛认可。
灵敏度:qRT-PCR > Northern blot
特异性:Northern blot > qRT-PCR
RNA和蛋白互作验证
RNA-pull down
已知RNA,寻找结合蛋白。
RNA pull-down实验就是先将RNA进行标记(如生物素探针标记)再与蛋白共同孵育,从而形成RNA-蛋白质复合物,通过SDS-PAGE分离蛋白质,最后通过WB(western blot)或质谱(mass Spectrometry)检测蛋白质。
该技术用于寻找与目的RNA结合的蛋白。
RIP
已知蛋白,寻找RNA。
RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀)技术采用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经分离纯化对RNA进行分析。
该技术用于寻找与目的蛋白结合的RNA。
EMSA
已知RNA,已知蛋白,判断是否结合。
EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay,凝胶迁移)技术是通过凝胶电泳迁移检测蛋白-RNA互作的一种技术。
首先将设计好的带有标记的RNA探针与样本蛋白混合孵育,形成蛋白-RNA复合物。因复合物分子量大,会在聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离,来确定RNA结合蛋白的特异性。
该技术用于体外验证预测的RNA与蛋白之间是否能够结合。
亚细胞定位研究
RNAFISH
RNAFISH,即RNA的免疫荧光原位杂交,是将已标记的RNA探针(可在探针上标记荧光基团、生物素、地高辛等)与组织切片或细胞中的待测RNA中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的RNA进行定性、定位和相对定量分析。
数据库
小编偷偷的告诉你(虽然有可能你早就知道),RNALocate数据库(http://www.rna-society.org/rnalocate)收录了超过42,000个人工收集的RNA的亚细胞定位信息,包含超过23,100个RNA,在65个物种中的42个亚细胞定位。lncATLAS数据库(http://lncatlas.crg.eu/)则是一个专门收录lncRNA亚细胞定位的数据库。有需要的可以先去查询!
休息休息一下~这一期就到这里吧~
下期关于转录组相关的实验验证如功能获得&缺失、细胞模型&动物模型见!
参考文献:
Zhang T , Tan P , Wang L , et al. RNALocate: A resource for RNA subcellular localizations[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(Database issue).
Mas-Ponte D, Carlevaro-Fita J, Palumbo E, Pulido TH, Guigo R, Johnson R. LncATLAS database for subcellular localization of long noncoding RNAs. Rna. 2017 Jul 1;23(7):1080-7.