转录组分析 | 使用Trimmomatic过滤Fastq文件

随着测序成本的不断降低，RNA-seq已经是许多实验的标配。经过小编一段时间的准备，接下来的几周时间里，将推出一系列的转录组分析教程，教大家从零开始学习转录组分析，欢迎大家持续关注！

上一期，小编教大家使用FastQC评估了自己手中RNA-seq数据的质量，今天教大家使用Trimmomatic切除数据中的接头序列和低质量序列。

## 下载Trimmomatic
wget -c http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic/Trimmomatic-0.39.zip
## 解压
unzip Trimmomatic-0.39.zip
## 进入目录
cd Trimmomatic-0.39

进入目录后，我们可以看到Trimmomatic的执行文件是一个Java文件，所以在运行前，需要先安装Java。

安装好Java后，就可以运行程序啦！

## 切除接头序列
java -jar ./trimmomatic-0.39.jar PE -phred33 -trimlog seq.log -threads 4 seq1.fq.gz seq2.fq.gz seq1.clean.fq.gz seq1.unpaired.fq.gz seq2.clean.fq.gz seq2.unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:./adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 SLIDINGWINDOW:5:20 LEADING:5 TRAILING:5 MINLEN:50

参数介绍：

PE：过滤双端测序数据（如果数据是单端测序的，则用SE）。

phred33：Fastq文件的质量值格式为phred33，一般二代测序数据的格式基本都是phred33，如果不清楚自己数据格式的话可以咨询测序公司。

trimlog：设置日志文件。

threads：设置线程数。

seq*.fq.gz：需要过滤的Fastq文件。

seq*.clean.fq.gz：过滤后的Fastq文件。

ILLUMINACLIP: ./adapters/TruSeq3-PE.fa指去除illumina测序平台下的TruSeq3接头序列，具体使用哪个接头序列可以咨询测序公司。

接头序列后跟的3个数字（2:30:10）分别代表比对时允许的最大错配数，两条reads与接头序列的匹配率和单条reads与接头的匹配率。2:30:10即表示，在比对接头序列时允许有两个位置的碱基发生错配，双端测序的两条reads与接头序列匹配率超过30%的话，就会被切除掉，单条reads如果与接头序列的匹配率超过10%，也会被切除掉。

SLIDINGWINDOW:5:20表示以5bp为窗口进行滑窗统计，切除碱基平均质量低于20的窗口及之后的序列。

LEADING:5表示切除reads 5’端质量值低于5的碱基，直到某一个碱基的质量值大于5。

TRAILING:5表示切除reads 3’端质量值低于5的碱基，直到某一个碱基的质量值大于5。

MINLEN:50表示去除过滤后长度低于50的reads。

除了这些参数外，如果我们想要切除reads开头的碱基，可以使用HEADCROP 参数。

## 切除reads开头碱基
java -jar ./trimmomatic-0.39.jar PE -phred33 -trimlog seq.log seq1.fq.gz seq2.fq.gz seq1.clean.fq.gz seq1.unpaired.fq.gz seq2.clean.fq.gz seq2.unpaired.fq.gz HEADCROP:9

HEADCROP:9表示切除reads开头9个碱基。

如果想切除reads末端的序列，仅保留前一部分，可以使用CROP 参数。

## 切除reads末端碱基
java -jar ./trimmomatic-0.39.jar PE -phred33 -trimlog seq.log seq1.fq.gz seq2.fq.gz seq1.clean.fq.gz seq1.unpaired.fq.gz seq2.clean.fq.gz seq2.unpaired.fq.gz CROP:130

假设reads长度为150，CROP:130代表切除reads后20个碱基，仅保留前130个碱基。

参考资料：

https://zhuanlan.zhihu.com/p/28802083

https://www.jianshu.com/p/a8935adebaae

http://www.usadellab.org/cms/uploads/supplementary/Trimmomatic/TrimmomaticManual_V0.32.pdf

转录组分析教程：

转录组分析 | 使用FastQC进行数据质控