转录组分析 | 使用FastQC进行数据质控
随着测序成本的不断降低，RNA-seq已经是许多实验的标配。经过小编一段时间的准备，接下来的几周时间里，将推出一系列的转录组分析教程，教大家从零开始学习转录组分析，欢迎大家持续关注！
在拿到测序数据后，我们首先要了解手中数据的质量，因为测序的质量直接影响下游分析的准确性，所以在我们进行转录组数据分析前，第一步应该判断测序质量的好坏。
判断测序数据质量的工具有很多，今天教大家用FastQC 检测测序数据的质量。
## 下载FastQC
wget -c http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/fastqc_v0.11.8.zip
## 解压unzip
fastqc_v0.11.8.zip
## 进入目录
cd FastQC
## 运行FastQC
./fastqc seq1.fq.gz seq2.fq.gz -ooutput_dir -t threads-o：输出文件目录
-t：线程数
运行完FastQC以后，输出目录下会产生一个fastqc.html文件，我们可以打开该文件来评估测序数据的质量。
FastQC产生的结果文件中主要包含以下几个指标：
其中绿色代表通过质控（质量高），橙色代表警告（质量一般，数据还可以用），红色代表未通过质控（质量差，需要确定一下该指标未通过的原因）。
指标1：基本统计信息
表格展示了我们数据的基本信息。从表格里我们可以得出fastq文件的测序平台，总reads数，reads长度和GC含量等信息。
指标2：碱基测序质量
图中横坐标表示每条reads上碱基的位置，由图可知，我们的reads长150。纵坐标表示碱基的质量值QUAL，该QUAL=-10*log10(碱基错误率)，如果QUAL为20，则表示该处碱基测序错误率为1%（0.01），如果QUAL为30，则表示该处碱基测序错误率为0.1%（0.001）。黄色的箱形图表示所有reads在这个位置的质量值分布，箱形图上的红线代表质量值的中位数，蓝线代表质量值的平均数。一般来说，reads末端的碱基质量值会低一些，但是只要没有大面积的碱基质量低于20，问题都不是很大。如果一些位置碱基质量太低的话，可以考虑去掉。
指标3：每条reads的碱基质量平均值
图中横坐标表示每条reads的碱基质量平均值，纵坐标表示reads数。由图可知，大部分reads的碱基质量平均值集中在36左右，几乎全部reads的碱基质量平均值都在20以上，说明测序质量非常好。
指标4：碱基分布情况
图中横坐标表示每条reads上碱基的位置，纵坐标表示每种碱基在该位置数量的百分比。一般来说，如果测序过程是随机的话，A和T的比例应该相近，C与G的比例也应该相近，像图中9bp前出现的碱基比例波动其实是正常的。如果大家发现自己的数据只是前2bp有波动，其实数据还是可以的，因为测序开始时，状态不稳定，很容易产生波动。
指标5：GC含量统计
图中横坐标为reads的GC含量，纵坐标是reads的数目。蓝线是GC含量理论值，红线是实际值。一般来说两个曲线越接近数据质量越好。像上图这种情况，有可能是某些区域被反复测序导致的。
指标6：N碱基含量
图中横坐标表示每条reads上碱基的位置。纵坐标表示N碱基的百分比。理论上N碱基应该如图所示，基本是不存在的。
指标7：reads长度分布
图中横坐标表示reads的长度，纵坐标表示reads的数量。由图可知，数据里reads的长度集中在150bp，未出现极短的reads，说明数据质量较好。
指标8：重复序列比例
图中横坐标表示reads重复次数，纵坐标表示reads比例。蓝线表示所有reads的分布情况，红线表示去重后reads的分布情况。如果含有的重复序列超过50%，说明测序数据可能有一些问题。
指标9：过表达序列
过表达序列指大量重复出现的序列，图中显示无过表达序列，说明测序质量很好。
指标10：接头序列
图中横坐标表示每条reads上碱基的位置。纵坐标表示接头序列碱基的百分比。图中显示数据中不含接头序列。
通过以上10个指标对测序数据进行初步评估，我们就可以对自己数据的质量有一个大概了解，进入下一步的分析阶段。
如果对以上步骤有任何疑问，可以随时在后台与小编交流~
参考资料：
https://zhuanlan.zhihu.com/p/28802083
https://www.jianshu.com/p/fe6af418a8bc
http://blog.sciencenet.cn/blog-3406804-1161193.html
http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Help/3%20Analysis%20Modules/