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大家好，今天和大家分享的是去年10月份发表在Modern Pathology (IF：5.988)杂志上的一篇文章，“Genetic analysis of pleomorphic and florid lobular carcinoma in situ variants: frequent ERBB2/ERBB3 alterations and clonal relationship to classic lobular carcinoma in situ and invasive lobular carcinoma”，作者通过对于收集病例的关联分析，解释了PLCIS/FLCIS与并发CLCIS和ILC之间的克隆关系，描绘了小叶瘤形成过程中的遗传进展，并揭示了ERBB2和ERBB3激活突变或扩增与PLCIS，FLCIS和相关的ILC更具侵略性的行为的关系。

Genetic analysis of pleomorphic and florid lobular carcinoma in situ variants: frequent ERBB2/ERBB3 alterations and clonal relationship to classic lobular carcinoma in situ and invasive lobular carcinoma

多形性小叶原位癌和旺炽性小叶原位癌的遗传分析：ERBB2 / ERBB3频繁改变和克隆与经典小叶原位癌和浸润性小叶癌的关系

一、研究背景

Pleomorphic（PLCIS）和Florid（FLCIS）原位小叶癌是LCIS的罕见组织学变异，被认为比经典LCIS更具侵袭性，但最佳治疗方案尚存争议。PLCIS和FLCIS被认为比CLCIS的风险更高，有研究间接指出这些亚型患者比ILCIS更容易患ILC。然而，PLCIS和FLCIS的遗传学和分子驱动因素仍是未知之数。

先前研究研究仅限于通过阵列比较基因组杂交（aCGH）进行的CNA分析， 分析了未配对的PLCIS / FLCIS和CLCIS，因此仅间接推断了这些病变与CLCIS的克隆关系。关于肿瘤进展，CLCIS，LCIS变体和ILC之间的遗传关系的性质仍然未知。

作者分析16个LCIS变体（十个PLCIS，六个FLCIS）的基因组情况，以对病灶的遗传驱动因素及其与CLCIS和ILC的克隆关系进行鉴定。

二、研究思路

三、结果解析

1、多形性、旺炽性小叶状原位癌和并发浸润癌的临床病理特征

表1:研究人群的临床病理特征。

• 所有患者均为女性，PLCIS的平均年龄为63岁（53-81岁），FLCIS的平均年龄为53岁（40-68岁），混合PLCIS / FLCIS的平均年龄是67岁（60-74岁）。
• 在CLCIS背景下出现了14个LCIS变体
  • 五个PLCIS，五个FLCIS和所有四个混合的PLCIS / FLCIS，并且有11个LCIS变体（五个PLCIS，三个FLCIS和三个混合PLCIS / FLCIS）与并发ILC相关联。
  • 3例PLCIS和1例PLCIS / FLCIS混合型也具有并发乳腺导管内原位癌（DCIS），1例PLCIS / FLCIS混合型具有并发DCIS和少量浸润性导管癌。
• 所有伴有ILC的患者均接受手术切除和腋窝淋巴结取样。
  • LCIS变体的平均大小为4.3厘米（范围为1.8至10厘米），并发ILC的平均大小为3.4厘米（范围为0.3至9.1厘米）。
  • 与PLCIS或PLCIS / FLCIS混合的侵袭性癌均为多形性ILC，镜下只有一种情况（88％，n = 8）（图1b）。
  • 所有与FLCIS相关的浸润性癌均为经典ILC（图1f）。
• 9例（82％）ILC认定为modified Scarff-Bloom-Richardson（mSBR）2级，而2例（18％）为mSBR 3级。2例ILC合并PLCIS / FLCIS伴发淋巴结转移。其余患者均为淋巴结阴性。
• 一名淋巴结转移患者死于疾病（存活20个月）；所有其他浸润性癌患者均活着，没有疾病迹象（平均随访47个月）五个LCIS变体 所有患者均活着，没有疾病迹象（平均随访55个月）。

图1:不同类型LCIS经典镜下表现

2、不同类型LCIS中的biomarker表达

通过免疫组化检测在测序的LCIS变体（十个PLCIS，六个FLCIS）以及测序的并发CLCIS和ILC中评估生物标志物的表达。

• 七个PLCIS为ER阳性，三个为ER阴性。
• 所有FLCIS均为ER阳性，5/6为PR阳性。
  • 两个PLCIS具有ERBB2扩增和HER2蛋白过表达。9/11病例中成对ILC的激素受体和HER2状态与各自的LCIS变异相关（表1）。在例外情况中，一个PLCIS的ER阳性弱，而并发ILC为三阴性，而一个FLCIS的PR阳性，而并发ILC为PR阴性。
  • 成对的CLCIS的激素受体和HER2状态与3/5 PLCIS和3/3 FLCIS中各自的LCIS变异有关。PR阴性PLCIS的两个案例具有并发PR阳性CLCIS。在一种情况下，成对的CLCIS，PLCIS和ILC均为三重（ER，PR和HER2）阳性（补充图S1C-F）。

图S1：免疫组化结果

3、关于PLCIS和FLCIS的基因分析

作者使用了DNA测序鉴别了PLCIS和FLCIS中的基因改变 ：

图2：PLCIS和FLCIS中鉴定出的预测致病性和/或复发性变化

• 图2显示了在PLCIS和FLCIS中鉴定出的预测致病性和/或复发性变化
• 基因总体改变
  • UCSF500面板基因中非同义编码突变的平均数在PLCIS（7.3±3.1）和FLCIS（8.0±1.8）之间是相似的（分别为p = 0.693，n = 7和4）
  • 预计的致病性平均数每个病例的变化也相似（PLCIS为4.3±0.9，n = 10，而FLCIS为5±2.1，n =6）（p = 0.371）。
• CDH1改变
  • 94％（15/16）的病例在CDH1中发生移码，无义或错义突变，杂合性丧失93％（14/15），与小叶分化一致。
  • 没有CDH1突变的单例病例（PLCIS，P2）具有单等位基因16q缺失，并且免疫组织化学证实了E-钙黏着蛋白的丢失。
• PIK3通路改变
  • PIK3CA和/或PIK3R1的致病性改变存在于70％的PLCIS和67％的FLCIS中，最常见的是在PIK3CA的螺旋或激酶域中组成性激活热点突变（七个PLCIS和两个FLCIS）。
  • 所有PLCIS和FLCIS在ERBB2，ERBB3和/或下游磷脂酰肌醇3激酶（PI-3K）通路基因中均具有致病性改变。
• ERBB2改变
  • 60％的PLCIS（6/10）带有致病性ERBB2改变，其中4例ERBB2激酶结构域中含有已知热点突变，另外2例含有ERBB2扩增（图2和补充图S2A）。三个测序的纯PLCIS中的两个具有ERBB2激酶结构域突变。
  • 在33％（2/6）的FLCIS中也发现了热点ERBB2突变，但没有带来扩增。
  • 一个PLCIS和两个FLCIS带有ERBB3突变，其中包括已知的致病性激酶结构域和细胞外结构域突变。
  • 三个ERBB3突变中的两个与热点ERBB2突变同时发生。与此同时，ERBB2和/或ERBB3改变出现在60％（6/10）PLCIS和50％（3/6）FLCIS中。
• FOXA1突变
  • 在40％（4/10）PLCIS和17％（1/6）FLCIS中发现了叉头转录因子FOXA1的突变。
  • PLCIS中的FOXA1突变被截断
  • 在FLCIS病例（F4）中，叉头结构域中有两个附近的FOXA1错义突变（p.C258W和p.C268W）出现在单独的等位基因上。
• 其他突变
  • 在30％（3/10）的PLCIS中被发现，但在FLCIS中未发现。
  • 在FLCIS（2/6）中发现了CBFB突变，而在PLCIS中则没有。
  • 其他经常改变的基因包括CCND1（在2/10 PLCIS和1/6 FLCIS中扩增），GATA3（1/10 PLCIS和1/6 FLCIS中缺失突变）和ARHGAP35（1/10 PLCIS和1/6 FLCIS中的截短突变）。
  • 一名患有PLCIS（P3）和ERBB2扩增的患者是种系致病性BRCA2携带者（p.V3365fs），但在该等位基因中，没有一个病变样本显示出体细胞杂合性丧失。
• 拷贝数分析
  • 全部病例均存在16q丢失
  • 73％（n = 15）的1q重复
• PLCIS（n = 9）的平均值为11.3±9.3 CNA，而FLCIS（n = 6）的平均值为4.7±2.9（p = 0.116，双侧t检验）。
  • 33％（3/9）PLCIS和33％（2/6）FLCIS中8q或全染色体8获得
  • 44％（4/9）PLCIS和33％（2/6）FLCIS中的远端或全臂11q缺失
  • 44％（4/9）PLCIS和17％（1/6）FLCIS中13q或全染色体13缺失
  • 22％（2/9）PLCIS和33％（2/6）FLCIS中的远端或全臂16p增长
  • 56％（5/9）PLCIS和17％（1/6）FLCIS中的远端或全臂17p缺失
  • 33％（3/9）PLCIS和17％（1/6）FLCIS中的间质或全臂17q的获得
  • 44％（4/9）PLCIS和17％（1/6）FLCIS中的远端或全臂18q或全染色体18的缺失
  • 额外的复发性CNA包括
  • 44％（4/9）PLCIS和33％（2/6）FLCIS的远端或全臂8p缺失
• UCSF500基因检测结果
  • 浸润性癌相关的LCIS变异体与无浸润性癌的纯LCIS变异体之间，PLCIS或FLCIS的突变谱以及每个病例UCSF500面板基因的预测致病性突变总数相似 .
  • 在两组中都包括ERBB2和ERBB3突变（图2）。
  • 尽管与浸润性癌相关的LCIS变体（10.8±9.1）和单纯的LCIS变体（4.4±1.8; p = 0.15）之间的平均CNA相似，但在前一组中观察到的CNA变异范围更大，这与相关的ILC紧密平行（图3和补充表S4）。
  • 纯PLCIS中不存在与浸润性癌相关PLCIS中的复发性CNA，包括远端或全臂11q缺失（4/7 vs.0/3），13q或全染色体13的缺失（4/7 vs.0/3） ，以及远端或全臂17p缺失（5/7与0/3）。

4、PLCIS和FLCIS与并发CLCIS和浸润性小叶癌（ILC）的遗传关系

作者对于11例并发浸润癌患者，比较了配对并发组的基因表达关系（sequencing results were compared across paired synchronous components (PLCIS or FLCIS, ILC, and CLCIS, when available)），以鉴定与进展相关的克隆关系和遗传特征。

图3：配对的经典LCIS，PLCIS或FLCIS和浸润性小叶癌的预测致病性与复发性改变的摘要

图4：配对的经典LCIS，PLCIS和FLCIS的拷贝数改变

• 在9个案例中，在8个案例中（89％），除LCIS变体（5/6 PLCIS，3/3 FLCIS）外还对并发CLCIS进行了测序，
  • 配对的组件彼此之间存在克隆关联，并共享病原畸变和CNA。
  • 在两个案例（PLCIS案例P7和FLCIS案例F3）中鉴定出了克隆不同的CLCIS组件，这两个案例中都携带了与成对的LCIS变体和ILC不同的CDH1移码突变。
  • 在其中一个（案例F3）中，对CLCIS的第二个焦点进行了测序，发现与配对的FLCIS / ILC具有克隆关系。
  • 除LCIS变体（七个PLCIS，四个FLCIS）外，在所有对并发ILC进行了测序的所有11种情况下，配对的组分彼此之间都是克隆相关的，并具有共同的致病突变和CNA。
  • 在所有与克隆相关的病例中，CLCIS，PLCIS或FLCIS和ILC之间共享16q和CDH1突变的缺失。
  • 在CLCIS和热点PIK3CA突变配对的4例病例中，有3例（两个PLCIS，一个FLCIS）是CLCIS和LCIS变异之间的克隆突变共有，与其他研究表明PIK3CA突变倾向于在小叶癌变早期发生且是在CLCIS阶段结果相吻合。
• PLCIS的相关基因改变
  • 在可评估的TP53突变病例中，从CLCIS到PLCIS的进展与TP53突变有关。
  • 其中一个（P5）在成对的PLCIS和ILC中具有相同的截短TP53突变，而另一个（P3）在PLCIS和ILC中具有不同的TP53突变，表明在此阶段driver-level genetic的遗传差异。
  • 2/5 CLCIS和3/7 PLCIS在其各自的成对组件中不存在独家致病突变（private pathogenic mutations ），而2/6 PLCIS在成对的ILC中不存在独家CNA。
  • 在一种情况下（P6），向PLCIS的进展与伴随的致病性ERBB2和ERBB3突变相关，向ILC的进展与另外两个独家ERBB3突变相关。
  • 但是，另外两个案例在所有三个组件（CLCIS，PLCIS和ILC）之间共享ERBB2突变（P5）或ERBB2扩增（P3）
  • 这表明ERBB2畸变可能在多形小叶瘤形成途径的早期或晚期发生。类似地，一个病例中，CCND1扩增与从CLCIS到PLCIS / ILC的进展有关，而在另一种情况下，在所有三个成分中均存在CCND1扩增（P4）。
  • CNA的比较没有显著的统计学差异（PLCIS中的平均值为14.8±9.6，ILC中的平均值为17.2±8.4）（p = 0.376，配对的双侧t检验，n = 6）。
  • PLCIS与并发ILC具有相似或相同的CNA（图4），其中包括两个PLCIS，其CNA比关联的ILC多。
  • 在三个可评估的CLCIS病例中，平均CNA（6.7±3.4，n = 3）也小于配对ILC，尽管配对病变的样本量太小，无法进行有意义的统计分析（补充表S4）。
  • 从PLCIS到ILC的进展与3/7（43％）病例中的其他克隆致病突变相关，其中一个病例（P1）包括NF1，WRN和HIST1H3B，另一病例（P3）包括CDKN1B和KMT2A，第三例包括ERBB3 （P6）。
  • 从PLCIS到ILC的进展与非同义编码突变总数的显著增加无关
  • 成对的CLCIS具有比ILC少的非同义编码突变（平均4.4±2.6）（p = 0.027，配对双侧t检验n=5）。
  • 从PLCIS到ILC的进展在4/6（67％）的病例中还与额外的CNA有关，包括在两种情况下（P3和P6）的4p或全染色体4复发性丢失。没有其他复发性改变与侵袭进展相关。
  • 与配对的CLCIS相比，PLCIS在4/5（80％）的病例中与其他克隆致病突变相关，在2/3（67％）的病例中与额外的CNA相关。
  • 配对分析显示，与CLCIS（平均4.4±2.6）相比，PLCIS中每例UCSF500面板基因的检测中，存在更多同义编码突变（平均6.6±3.3）（p = 0.03，n = 6）。
• FLCIS进展与基因改变
  • 从CLCIS到FLCIS的进展仅在1例（F4）中与其他克隆致病突变相关，其中包括PIK3R1，FOXA1和KMT2C（图3）。
  • 但是，成对的FLCIS和ILC在遗传上是不同的，在两个组件中都有不同的克隆FOXA1突变，并且与CLCIS和ILC相比，FLCIS还具有其他独家克隆和亚克隆致病突变。所有四例FLCIS患者在FLCIS组件中均具有独家致病性突变，再次提示在此小叶癌变水平上driver-level genetic的遗传差异。
  • 总体而言，ILC中非同义编码突变的平均数为5.3±1.5，而FLCIS中为7.8±2.1，CLCIS中为4.3±2.6，但成对病变的样本量太小，无法进行有意义的统计分析。
  • 在ILC中，每例平均CNA为11.3±8.5，而在FLCIS中为4.8±3.8（p = 0.07，配对t检验，n = 4），并且与FLCIS相比，所有四例在ILC中均具有额外的独家CNA。在两个具有CLCIS的可评估病例中，在成对的FLCIS中未发现其他CNA。
  • 在一种情况下（F4），FLCIS只有两个CNA（1q重复和16缺失），与并发CLCIS相同，但少于相关的ILC。
  • CNA与成对的CLCIS结合使用，而不是FLCIS，提示肿瘤从CLCIS而非FLCIS直接发展为ILC。在其余三例中，向ILC的进展与MCL1和RB1（F1），ASXL2（F3）和FOXA1（F4）的克隆病原体畸变有关。没有发现与侵袭进展相关的复发性改变。

5、PLCIS和FLCIS与其他浸润性小叶癌的遗传学比较

作者将研究中的PLCIS，FLCIS和相关ILC的基因组图谱与先前在TCGA中分析过的ILC的公开测序数据（n = 127）进行了比较（图5）。

• 与TCGA队列中的ILC相比，PLCIS，FLCIS和LCIS变体相关的ILC比TCGA队列中ILC更有可能带有ERBB2突变或具有ERBB2或ERBB3改变。
• ERBB3突变在FLCIS（33％）中比在TCGA ILC（1％）中更为常见（p = 0.005）。
• 在TCGA队列中，PLCIS中的FOXA1突变比ILC更频繁（40％）（7％）（p = 0.008），并且这种趋势在与LCIS变异相关的ILC中趋于重要（27％，p = 0.056）。
• 在TCGA队列中，与PLCIS相关的ILC携带TP53突变的频率高于ILC（分别为43％和8％；p = 0.02），在HIST1H3B中也更可能包含TP53突变（29％和2％，p = 0.02）。与PLCIS，FLCIS和/或相关的ILC相比，与这些LCIS变体相关的CLCIS与TCGA队列中的ILC之间没有显着差异。

图5：在癌症基因组图谱（TCGA）中比较LCIS变异体和相关的浸润性小叶癌的遗传学。

小结

这篇文章通过自己样本的数据进行了深入的挖掘，展现了PLCIS和FCILS这两种CILS亚型的遗传发展关系，一定程度上为目前对于这两种亚型的治疗方案选择提供了标准。从文章的具体工作来看，亮点更多地体现在后面样本的对比分析上，通过基因对比分析来展现PLCIS及FCILS的发育以及侵袭性的证据。

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编辑：虾仁饭

校审：糯米饭