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图像背景校正操作错误,结果千差万别......

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Mark Chen
发布2020-10-21 17:01:26
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发布2020-10-21 17:01:26
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文章被收录于专栏:聊点学术

聊点学术

在进行图像定量分析之前,必须首先对图像背景进行校正。如果不作此操作,有时可能会出现极大或极小值,批量分析后得到的数据是不可信的。

▼1. 背景校正的原理是什么?

背景校正操作可以修正图像不均匀的背景强度,补偿不均匀光照、不均匀底片、微小的瑕疵。如下情况:

1.1 在明场下,显微镜的视野内光强分布是不均一的,表现为正中心比周围要亮,免疫组化(DAB)图像就是在这种光学环境下被采集的。尽管高倍镜下肉眼难以识别,但这种光强分布差异会对分析结果造成不小的影响。

(示例明场光强差异)

1.2 荧光染色时最大的障碍就是背景染色。背景染色在整张图上不均一,导致分析时无法有效选定目标区域;

1.3 显微镜光路上的灰尘在图像上留下杂点,影响分析;

1.4 封片剂在玻片上分布不均一,拍照后得到的图像对焦不准,影响分析

以上列举的种种问题都会对图像分析产生极大影响,定量分析前必须进行图像预处理操作,即背景校正。

▼2. 为什么免疫组化(DAB)和荧光染色图像校正存在区别?

二者的本质区别就是光密度与灰度的区别。

◣ 2.1 免疫组化(DAB)染色定量分析的主要指标就是积分光密度。

积分光密度代表的是分析区域内所有像素光密度值的总和,可以反映分析区域内某种成分的总含量。(往期回顾:聊一聊 Image-Pro Plus 测量平均光密度。

光密度是不能直接测量的,而必须间接测量得到。因此,光密度值测量前的背景校正(红和绿和蓝)需要在平面场校正下进行,而不是单纯的线性函数扣减。

◣2.2 荧光染色图像分析的本质是灰度分析。

荧光图像分析其实就是在单通道下(红或绿或蓝),对灰度值的分析。反映出在此通道下,图像上分析目标的灰度值,以灰度值的差异代表某物质量的差异。

灰度值背景校正可以直接通过线性函数扣减,即分析目标的灰度值减去图像背景灰度平均值。

▼3. 免疫组化(DAB)和荧光染色图像校正方法?

大家最喜欢的就是采用Image Pro Plus进行图像分析,那就以此为例吧。

◣3.1 免疫组化(DAB)图像背景校正

(1)点击measure,calibration,intensity。

(2)在弹窗中,首先点击New新建曲线,然后点击光密度Std. Optical Density,最后点击Option。

(3)在弹窗中点击“0”对应的Image,然后将鼠标移动到图像中最白的位置(没有任何组织或细胞的地方)点击。↓

多点几次,查看下图Current Value值,然后选定一个大致的平均值,例如180。↓

将180这个值手动填到对应位置后,点击OK。↓

(4)在接下来的批量分析其它图像时,不要关掉这个校正框,最小化即可。或者记住这个Intensity Cal 9,下次分析此批图片时,直接选择调用即可。↓

◣3.2 荧光染色图像背景校正

(1)先打开一幅需要校正的荧光图像,然后打开一幅无任何组织或细胞的图像(空白图像)。只有打开两张图才能选择Process下方的 background correction;否则该选项为灰色,无法选择。

(2)可以看出IPP给出两种校正模式。一般来讲,第一种背景扣减是最常用的,适用于绝大多数适合灰度分析的图像。其原理就是将从目标图像中扣减背景灰度平均值,这样生成的新图更利于定量分析。

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原始发表:2020-10-10,如有侵权请联系 cloudcommunity@tencent.com 删除

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