图像背景校正操作错误，结果千差万别......

聊点学术

在进行图像定量分析之前，必须首先对图像背景进行校正。如果不作此操作，有时可能会出现极大或极小值，批量分析后得到的数据是不可信的。

▼1. 背景校正的原理是什么？

背景校正操作可以修正图像不均匀的背景强度，补偿不均匀光照、不均匀底片、微小的瑕疵。如下情况：

◣ 1.1 在明场下，显微镜的视野内光强分布是不均一的，表现为正中心比周围要亮，免疫组化（DAB）图像就是在这种光学环境下被采集的。尽管高倍镜下肉眼难以识别，但这种光强分布差异会对分析结果造成不小的影响。

（示例明场光强差异）

◣ 1.2 荧光染色时最大的障碍就是背景染色。背景染色在整张图上不均一，导致分析时无法有效选定目标区域；

◣ 1.3 显微镜光路上的灰尘在图像上留下杂点，影响分析；

◣1.4 封片剂在玻片上分布不均一，拍照后得到的图像对焦不准，影响分析

以上列举的种种问题都会对图像分析产生极大影响，定量分析前必须进行图像预处理操作，即背景校正。

▼2. 为什么免疫组化（DAB）和荧光染色图像校正存在区别？

二者的本质区别就是光密度与灰度的区别。

◣ 2.1 免疫组化（DAB）染色定量分析的主要指标就是积分光密度。

积分光密度代表的是分析区域内所有像素光密度值的总和，可以反映分析区域内某种成分的总含量。（往期回顾：聊一聊 Image-Pro Plus 测量平均光密度。）

光密度是不能直接测量的，而必须间接测量得到。因此，光密度值测量前的背景校正（红和绿和蓝）需要在平面场校正下进行，而不是单纯的线性函数扣减。

◣2.2 荧光染色图像分析的本质是灰度分析。

荧光图像分析其实就是在单通道下（红或绿或蓝），对灰度值的分析。反映出在此通道下，图像上分析目标的灰度值，以灰度值的差异代表某物质量的差异。

灰度值背景校正可以直接通过线性函数扣减，即分析目标的灰度值减去图像背景灰度平均值。

▼3. 免疫组化（DAB）和荧光染色图像校正方法？

大家最喜欢的就是采用Image Pro Plus进行图像分析，那就以此为例吧。

◣3.1 免疫组化（DAB）图像背景校正

（1）点击measure，calibration，intensity。

（2）在弹窗中，首先点击New新建曲线，然后点击光密度Std. Optical Density，最后点击Option。

（3）在弹窗中点击“0”对应的Image，然后将鼠标移动到图像中最白的位置（没有任何组织或细胞的地方）点击。↓

多点几次，查看下图Current Value值，然后选定一个大致的平均值，例如180。↓

将180这个值手动填到对应位置后，点击OK。↓

（4）在接下来的批量分析其它图像时，不要关掉这个校正框，最小化即可。或者记住这个Intensity Cal 9，下次分析此批图片时，直接选择调用即可。↓

◣3.2 荧光染色图像背景校正

（1）先打开一幅需要校正的荧光图像，然后打开一幅无任何组织或细胞的图像（空白图像）。只有打开两张图才能选择Process下方的 background correction；否则该选项为灰色，无法选择。

（2）可以看出IPP给出两种校正模式。一般来讲，第一种背景扣减是最常用的，适用于绝大多数适合灰度分析的图像。其原理就是将从目标图像中扣减背景灰度平均值，这样生成的新图更利于定量分析。