程序性细胞坏死？细胞“铁死亡(Ferroptosis)”的那些事。

细胞死亡是一切细胞的宿命，细胞死亡的方式也是生物医学领域的重大问题，这方面现在已经比较成熟的研究包括细胞凋亡、细胞自噬、细胞坏死，其中细胞坏死是最新研究的热点，过去曾经认为细胞坏死都是非程序性的，或者是意外发生的。现在发现细胞坏死不仅存在程序或调节，而且存在许多不同类型的细胞坏死类型。例如程序性细胞坏死，程序性铁坏死等。其中铁坏死是近年来才发现的程序性细胞坏死类型，这种坏死的特点是依赖铁离子，是一种氧化损伤类的细胞坏死。

铁死亡（Ferroptosis）最早由Dr. Brent R.Stockwell在2012年提出：一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式。

主要有以下几个特点：

①细胞死亡过程中伴随着大量的铁离子的累积，同时还会出现脂质过氧化；

②在细胞的细微结构中，会出现比正常细胞小的线粒体，且线粒体膜皱缩，同时线粒体嵴减少、消失，外膜破碎。

铁死亡是跟之前发现的各种死亡形式，例如：凋亡、自噬、焦亡等等都不相同的一种新的死亡形式，表现在形态学、生物化学、遗传学方面。

在形态学方面，主要是表现为线粒体体积的缩小，双层膜密度增加、线粒体嵴减少或消失；

在生物化学方面，主要是谷胱甘肽的耗竭，GPX4活性下降，脂质氧化物不能通过GPX4催化的谷胱甘肽还原酶反应代谢，之后二价的铁离子可以氧化脂质产生活性氧，从而促使铁死亡的发生；

在遗传学方面，主要发现调控铁稳态和脂质过氧化代谢等方面的基因改变。

——故铁死亡主要在氨基酸代谢、氧化应激、铁代谢相关机制等机制中发挥了作用。

胱氨酸-谷氨酸反向转运体是细胞内重要的抗氧化体系，可以摄取胱氨酸，排出谷氨酸。摄取的胱氨酸被还原为半胱氨酸，参与谷胱甘肽的合成；谷胱甘肽可以在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下还原活性氧和活性氮；所以谷胱甘肽在体内是一种重要的抗氧化剂。而这种重要的细胞氧化应激途径，也在铁死亡中有重要的作用；于是铁死亡这一细胞死亡方式可作为细胞氧化应激发挥保护作用的一个新靶点。

铁是生命所必需的微量元素之一，铁代谢失衡会引起多种病变的发生。如铁能抑制SRSF7与细胞死亡受体Fas的mRNA前体结合，随后外显子6排除，导致突变的促凋亡的Fas亚型表达增加。在遗传性血色素沉着症患者中，ZIP14可能是一个促进肝细胞死亡的因子，其通过介导铁的转运，增强促凋亡蛋白Fas亚型的表达发挥促凋亡作用。铁参与体内多种重要的生理生化过程，包括了①氧的转运，②作为核糖核苷酸还原酶参与DNA的生物合成，③作为辅因子参与ATP的合成。

在铁死亡中，会出现明显的铁累积，这是在其他死亡形式中均没有发现的情况。因此，铁累积是区别于氧化应激通路，诱发铁死亡的一种独特的机制。

下图是铁死亡的机制：

图片来源：Cell, 2017, 171 (2) 273-285.

铁死亡的特征：

（1）超微形态学特征显示细胞膜断裂和出泡，线粒体变小、膜密度增高、线粒体脊减少或消失、线粒体外膜断裂，细胞核大小正常、但缺乏染色质凝聚。电镜下表现为细胞内线粒体变小及双层膜密度增高。

（2）生物学特征为铁和活性氧（ROS）聚集，激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase; MAPK）系统，通过降低胱氨酸的摄取、耗竭谷胱甘肽，抑制ystem Xc-和增加还原型酰腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，释放花生四烯酸等介质。

（3）免疫学特征为损伤相关分子模式（damage-associatedmolecular patterns molecules; DAMPs）释放前炎症介质（如高迁移率族蛋白B1等）。

（4）基因水平上主要受核糖体蛋白L8（ribosomalprotein L8;RPL8），铁反应元件结合蛋白（ironresponse elementbinding protein 2; IREB2），ATP合成酶F0复合体亚基C3（ATP synthase F0complex subunit C3; ATP5G3），三四肽重复结构域35（tetratricopeptiderepeat domain 35; TTC35），柠檬酸合成酶（citratesynthase; CS），酰基辅酶A合成酶家族成员2（acyl-CoAsynthetase family member 2; ACSF2）以及受代谢、储存基因TFRC、ISCU、FTH1、FTL、SLC11A2的调节。

铁死亡的信号通路：

铁死亡受细胞内信号通路的严密调节，包括铁稳态的调节通路，RAS通路以及胱氨酸转运通路。

铁死亡是由于膜脂修复酶——谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）失效，造成膜脂上活性氧自由基（ROS）的积累所致，而这一积累过程需要铁离子的参与。多种物质和外界条件可引发铁死亡。小分子erastin通过抑制质膜上的胱氨酸-谷氨酸交换体，降低了细胞对胱氨酸的获取，使得GPX4的底物——谷胱甘肽合成受阻，进而引发膜脂ROS的积累和铁死亡。此外，另一种小分子RSL3作为GPX4的抑制剂也可引发铁死亡。当GPX4基因被敲除后，小鼠会因出现肾衰竭而死亡。

图片来源：Progress in Biochemistry and Biophysics, 2013, 40(2): 137-140.

图片来源：本文作者.

铁死亡的检测方法：

1、相关活性：

① 细胞活性：CCK-8，MTT；

② 细胞内铁水平：使用PGSK探针检测，通过流式细胞术或共聚焦显微镜监测活细胞内铁含量的细胞膜透性染料，在铁死亡的细胞中，PGSK的绿色荧光会减弱；或者使用Iron Assay Kit检测细胞、组织中的铁水平。

③ 活性氧的水平：细胞内活性氧和脂质活性氧通过流式细胞术使用DCFH-DA（表达上调）或C11-BODIPY 荧光探针检测（在铁死亡细胞中，探针会由红色转化为绿色）。

④ qPCR/Western Blot：检测细胞内与铁死亡相关的因子的变化，例如COX-2,ACSL4,PTGS2,NOX1,GPX4和FTH1等，其中COX-2,ACSL4,PTGS2和NOX1在铁死亡细胞中表达上调；GPX4和FTH1在铁死亡细胞中表达下调。

2、形态观察：

① 透射电镜直接对细胞形态进行观察：细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大。

② 线粒体膜电位检测：通过流式细胞仪收集TMRE阳性细胞的比例。

③ 线粒体形态观察：向细胞内转染LifeAct-GFP荧光蛋白，一定时间后通过有丝分裂追踪器观察线粒体的形态。

铁死亡研究常用试剂

1、System Xc抑制剂，Erastin 及其类似物：sulfasalazine, glutamate, and sorafenib

2、GPX4 抑制剂：RSL3，ML162

3、FIN56：可耗尽GPX4和CoQ10

4、FINO2：可间接抑制GPX4，诱导脂质过氧化

研究进展

1、细胞铁死亡与肿瘤的关系

有研究发现，肾癌与白血病相比较肺、结肠等疾病更对铁死亡敏感，以往的研究普遍认为p53通过诱导细胞衰老，程序性死亡从而抑制肿瘤，最近的研究提示，p53控制代谢和铁死亡研究中，发挥很重要的作用，正常细胞中的p53可以负调控脂质的合成和糖酵解，正调控氧化磷酸化和脂质分解代谢，肿瘤细胞中突变型的p53正调控脂质的合成和糖酵解，所以，在正常的组织中，p53倾向于正向调节铁死亡；突变型的p53使肿瘤细胞对铁死亡更敏感。

2、细胞铁死亡与脑卒中的关系

在缺铁性脑卒中疾病中，Tau蛋白的功能失调，可能导致年龄依赖性铁介导的神经毒性，MCAO能够抑制3个月大的小鼠脑半球Tau蛋白的功能，并且使铁水平升高，但是在野生型小鼠中，受到铁螯合剂的干预保护，铁水平不会升高，表明Tau蛋白可以抑制铁死亡，在12月龄Tau敲除小鼠中，发生了年龄依赖性铁积累，抵消了Tau敲除后对MCAO诱导的局促性脑缺血再灌注损伤的保护作用。

3、铁死亡与帕金森

有研究证明，铁死亡很有可能是引起PD神经退行性变细胞死亡的通路之一，铁是治疗PD的有效靶点。在细胞和MPTP诱导的PD小鼠模型中运用铁螯合剂（去铁酮），能减少氧化应激，增强多巴胺可利用性，从而改善现有的运动症状和减少运动功能的退化。早期阶段的PD患者中，应用去铁酮治疗可减缓运动缺陷的进展，减少现有的运动症状。在MPTP治疗前24小时给小鼠注射铁死亡抑制剂ferrostatin-1可显著挽救行为障碍和神经元丢失，这表明常见的PD毒素在动物模型中引起神经退行性变的机制可能是铁死亡。

4、细胞铁死亡与肝脏损伤的关系

有研究运用多种基因敲除小鼠模型，发现高铁状态以及遗传性血色病铁过载可诱发肝脏（肝细胞及巨噬细胞）发生铁死亡，并且揭示了转运蛋白Slc7a11调控铁死亡的新机制，为肝脏损伤及血色病等系列重大疾病的防治提供了新思路。

关于Fe

铁是人体不可缺少的微量元素，它是构成血红蛋白、肌红蛋白及多种酶的重要成分，如果体内缺少铁，可影响血红蛋白、肌红白蛋的合成，可使某些酶，如细胞色素C、核糖核苷酸还原酶、琥珀酸脱氢酶等的活性降低。这些酶与生物氧化、组织呼吸、神经递质的分解与合成有着密切关系，因此，铁的缺乏可引起很多生理上的变化，从而导致免疫力低下，智力降低和机体抗感染能力降低，影响机体体温调节能力，神经机能紊乱，工作效率降低等各种疾病，最常见的是缺铁性贫血。当体内铁的含量和分布异常时，就会影响正常的生理功能，铁的代谢水平已经成为衡量人体健康状况的重要标志之一。如果铁在体内储存过多也会中毒。急性铁中毒的发生多见于儿童，多因误服铁制剂造成，死亡率很高，达20%左右。慢性中毒是长期过量服用铁制剂，或从食物中摄取了过多的铁造成，当人体内铁过量时，则会因不能及时排出体外而沉积于肝脏、胰脏、心脏和皮肤，从而引起血色病（血色素沉积）、肝功能异常、心肌损伤和糖尿病、肿瘤、骨质疏松等。