从零开始学PCR技术（四）：常见问题
PCR 反应可能存在问题，比如无扩增条带、有扩增条带但是假阳性、出现非特异性条带或者条带出现拖尾现象，这是因为 PCR 反应存在多个关键环节：1、模板核酸的制备；2、引物的质量与特异性；3、酶的质量；4、PCR 循环条件。任何一个环节出现差错都会导致 PCR 失败。
PCR 常见的四种问题
问题一：假阴性
现象：无扩增条带。
原因：
1.模板
- 模板中含有杂蛋白质、Taq 酶抑制剂，模板上样量低或模板降解；
- 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
- 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
2.引物
- 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因;
- 有些批号的引物质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增;
- 对策：① 选定一个好的引物合成单位。② 引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
3.酶
- 酶失活，需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。
4.Mg2+浓度
- Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。
5.反应程序
- 模板变性不彻底。如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；
- 退火温度不合适。退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率；
- 延伸时间不够，每种酶的能力与性质不同，需要根据每种酶的特点设定合适的延伸时间。
- 酶是否需要热启动等特殊程序。
6.靶序列变异
- 如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。
7.反应体积的改变
- 通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、30ul、50ul 或 100ul，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。
问题二：假阳性
现象：出现与目的扩增条带一致的条带。
原因：
- 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：① 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。② 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头等均应一次性使用。③ 必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。
- 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
问题三：非特异性扩增
现象：PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
原因：① 引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体; ②Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR 循环次数过多有关;③ 是酶的质和量，往往有些来源的酶易出现非特异条带而有些来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增;
对策：① 必要时重新设计引物。② 减低酶量或调换另一来源的酶。③ 降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④ 适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃ 变性，65℃ 左右退火与延伸)。
问题四：拖尾
现象：产物在凝胶上呈涂抹带。
原因：模板浓度低，酶量过多或酶的质量差，dNTP 浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起；
对策：① 减少或调换另一来源的酶。② 减少 dNTP 的浓度。③ 适 4 当降低 Mg2+浓度。④ 增加模板量，减少循环次数。
提高 PCR 特异性的四种策略
策略一：巢式 PCR（Nest-PCR）
- 巢式 PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少；
- 巢式 PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有 mRNA）的灵敏度，并且提高了困难 PCR（如 5'RACE）的特异性。
策略二：递减 PCR（TouchDown PCR）
- 递减 PCR 通过在 PCR 的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的 Tm高大约 5 ℃ 的退火温度下开始，然后每个循环降低 1-2 ℃，直到退火温度低于 Tm5 ℃；
- 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势；
- 递减 PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如 AFLP、DNA 指纹等。
策略三：热启动 PCR（HotStart PCR）
- 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度；
- 现在有很多公司都有 HotStart Taq 酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；
- 热启动 PCR 是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。
策略四：使用 PCR 增强剂
- 甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当 PCR 的增强剂；
- 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助 DNA 聚合酶延伸通过二级结构区；
- 增强剂浓度要适当。
注：本文内容来源于网络，仅供自己学习参考之用。
PCR 技术系列文章更新计划：
从零开始学 PCR 技术（四）：常见问题
从零开始学 PCR 技术（五）：试验污染
从零开始学 PCR 技术（六）：多重 PCR
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