单细胞分析揭示结肠癌髓系靶向治疗机制

分享是一种态度

今天给大家分享一篇北京大学张泽民老师在2020年4月16号在cell上发表的单细胞的文章，题为：Singlecell analysis inform mechanisms of myeloid target therapies in Colon cancer

Highlights

1. 单细胞RNA-seq分析说明了在人类和小鼠的结直肠癌中存在保守的骨髓细胞子集。
2. 两个完全不同的巨噬细胞各自显示了炎症和生成血管特性。
3. 两个不同的巨噬细胞对CSF1R blockade 不同程度的敏感性。
4. anti-CD40激活特异的cDC1s，并且扩增Th1-like和CD8+记忆T细胞。

InBrief:结合在结直肠癌和小鼠的肿瘤模型的肿瘤微环境的单细胞分析结果找到了对CSF1R blcokade 具有不同敏感性的髓系细胞，定义DC细胞和T细胞对anti-40治疗的不同的免疫反应。

Summary

背景：单细胞RNAseq是检测肿瘤中细胞多样性的有力的工具，但是利用它来阐明免疫调控治疗下面的机制的应用是很少的。

方法：在这篇文章中，他们对来自结直肠癌病人的免疫和基质种群细胞做了单细胞RNA分析

结论：

1. 找到了特异的巨噬细胞（specific macrophages）和传统的树突细胞（conventional dendritic cell ）是在肿瘤微环境里细胞相互作用的的关键调控子。
2. 定义了相当数量的髓系细胞在小鼠肿瘤里，保证捕获他们对髓系靶向，免疫治疗的反应。
3. 利用了anti-CSF1R治疗，会优先消耗具有炎症特性的巨噬细胞，但是却比较少消耗表达促进肿瘤形成，促进血管生成的基因的巨噬细胞。
4. 利用CD40 agonlist 抗体治疗会偏好的激活cDC种群，增加Bhlhe40+Th1-like的细胞和CD8+的记忆T细胞。

Introduction

免疫检查位点抑制（immune checkpoint blockade：ICB）具有通过肿瘤细胞扰乱免疫监督的能力， 极大的改变了肿瘤治疗策略。然而ICB只在一部分病人，并且特定的癌症中显示出活性。额外的治疗策略关于增强抗肿瘤的免疫已经被提出来了。包括减少在肿瘤微环境中促进肿瘤的或者免疫抑制的细胞，并且激活特异的免疫种群用agonistic 抗体。不幸的是我们对复杂的免疫微环境理解的不完全导致在临床上运用时是不加区分的，而不是基于清楚的了解做出选择。

单细胞RNA seq是检测固体肿瘤复杂性的有力的工具，保证了以前所未有的详细程度了解细胞的多样性和异质性。单细胞RNA seq基于转录分析不仅可以找到T细胞的异质性， 也可以阐明T细胞群体和受体之间的动态的相互关系。以前我们找出一个BHLHE40+ Th1-like细胞群体，这个群体十分显著的富集在具有微卫星不稳定的结直肠癌的肿瘤样本中，而在微卫星稳定的比较少见。考虑到只有微卫星不稳定的病人对ICB有反应，这些发现暗示了这些策略可能会增强T细胞的数量和功能去促进对ICB的反应。

最近，单细胞RNA seq 分析已经揭示了肿瘤浸润的髓系细胞的复杂性，包括肿瘤有关的巨噬细胞和DC细胞在不同癌症里。肿瘤有关的巨噬细胞（TAM）是一个异质性的细胞类型，可以通过产生肿瘤和生成血管的生长因子，细胞外重塑和免疫抑制促进肿瘤的恶化。然而免疫治疗目的在于抑制TAM的生物功能，同时促进临床效果，包括有扰乱巨噬细胞的扩张，阻碍CSF1R和它的受体CSF1和1L-34的相互作用。但是一个方面的治疗效果在对抗肿瘤方面已经明显被观察出来。

肿瘤相关的DCs细胞（树突细胞）只占据了髓系细胞的一小部分在肿瘤中，但是在抗肿瘤的T细胞反应中起着重要的作用。传统的DCs细胞可以很广泛的被分为两类cDC1和cDC2, 基于表型marker和功能角色。cDC2在肿瘤中的角色很难定义，但是cDC1对产生抗肿瘤的T细胞是十分重要的，因为他们可以向CD8+T细胞呈递肿瘤相关的抗体，多个策略去促进DCs的功能已经加速了临床上的发展，随着激活CD40受体的方法已经被广泛探索。然而与CSF1R抑制剂相似，CD40 agonistis已经显示了十分有限的单方面的治疗效果。我们之所以可以发展出髓系靶向治疗有关的策略是依赖于我们对肿瘤中髓系细胞异质性的综合理解，以及在肿瘤微环境中这些治疗对免疫细胞功能的影响。

最近已经有研究尝试把在人类癌症中单细胞RNAseq发现的髓系异质性和小鼠里找出的细胞类型联系起来。这种异质性的功能，不同髓系种群之间的关系，以及对于myeloid-target免疫治疗的不同反应依然比较少探索。在这篇文章里，他们利用了两种单细胞RNAseq的平台去做了一个高分辨率的分析，针对肿瘤中的免疫细胞，基底细胞，临近的正常组织和血样来自于CRC病人。他们更进一步构建了细胞之间相互作用去定义了参与肿瘤形成过程和抗肿瘤免疫中重要的细胞群，找出了TAM和DCs中特异的种群在细胞相互作用中有重要的作用。为了更好的理解调控这些这些细胞功能的后果，他们做了额外的单细胞RNA seq去找出经过anti-CSF1R和anti-CD40处理的小鼠肿瘤模型中的相似的免疫细胞子集。通过同时分析人类和小鼠的单细胞RNA seq数据，他们找到了这些细胞的异质性和功能，他们调试着肿瘤微环境，实现了髓系细胞调控治疗从预临床模型到人类癌症的的转变。

Results：

1 Intratumoral Cell Types in Human CRC Revealed by Combined Plate- and Droplet-based scRNA-seq

他们从18个没有接受治疗的结直肠癌病人的肿瘤，临近的正常组织，血样中的细胞做流式细胞分选搜集了CD45+和CD45-的细胞，这些细胞的转录组是通过10X Genomics 平台和全长的Smart-seq2平台做的，这些数据结合了2018年张泽民老师发表的来自于同一个病人的T细胞转录组，通过质量控制和过滤，他们获得了43，817（10XscRNA-seq）和10，468（Smart-seq2）的单细胞转录组测序数据。同我们预期的一样，Smart-seq可以捕获更多的基因，包括细胞因子，CD分子，配体/受体和转录因子，并且和10X scRNA seq 相比表现出微弱的批次效应。

为了确定肿瘤浸润的白细胞的亚群，他们分别给这两个数据集做了聚类，找到了主要的已知的细胞类型，包括髓系细胞，先天的淋巴细胞，T细胞和B细胞。更进一步的无监督聚类对每个成分总共生成了38个亚群（10X）和36个亚群（Smart-seq2）平台。然后他们做了一个先行回归模型去定义来自这两个数据集的种群之间的相似性和相关性。白血球细胞展现了高度的相似性被认为是相似的细胞子集，其余的细胞群因特有的基因特性被手动注释。对于淋巴细胞，肿瘤富集的血浆B细胞，肠道有关的淋巴结组织的B细胞，卵泡B细胞，生发中心的B细胞在两个平台间极度相似，可以被不同的免疫珠蛋白重链特性区分。同样的，所有平台都会捕获ILCs细胞，包括血液和组织富集的NK细胞，正常粘膜富集的ILC3细胞，以及肿瘤富集的组织特异的NK细胞，这些NK细胞表达抑制剂受体，细胞因子分子，扩增有关的基因与以前在结直肠癌中描述的CD8+ exhausted T 细胞特征相似。与淋巴细胞相反，髓系细胞在两个平台间显示出一个更高程度的多样性，尤其是被10x平台捕获的两个中间状态的单核子集，暗示了每个病人需要更测更多的细胞去找到稀少的或者过渡状态的细胞群，最后，我们获得了13个髓系细胞群，4个ILC群，18个T细胞种群，5个B细胞群来自这两个平台的，很大程度上和以前的对不同癌症类型的单细胞RNAseq 研究结果是一致的。来自于两个数据集的所有的细胞类型都可以通过t-SNE分析来看。每一个种群的细胞都来自不同的病人，以及具有不同的组织分布。

对于 来自Smart-seq2平台的非免疫的细胞，graph-based 聚类聚成了12类，恶性细胞，被推导的拷贝数变异所定义的，展示出高程度的异质性在基因表达方面，然后形成了病人特有的种群。与以前结直肠癌中的研究一致，他们找出了几个非恶性细胞群在正常的粘膜和肿瘤中，包括血管内皮细胞，4个种群的上皮细胞，2个种群的goblet细胞，通过top/button的基因特征以及两个种群的纤维细胞。值得注意的是所有的基成纤维细胞和癌症有关的纤维细胞在结直肠癌肿瘤中更容易被发现相比较正常粘膜。

总的来说， 这个SMART-Seq2平台会捕获更多的基因数，允许对调控的pathways有一个更有深度的分析， 10X平台可以很有效的得到更多的种群。Smart-seq2的深度和10X 单细胞RNAseq的广度可以让我们找到更多的细胞类型，或者罕见的细胞类群，并且提高细胞聚类的结果。然后我们利用了每个平台的独特优势去定义了肿瘤浸润的髓系细胞的特性以及他们和结直肠癌中其他细胞的相互作用。

2 Monocyte/Macrophage Subsets Show Tissue-Specific Patterns

他们首先检测出了在这个研究中13个髓系细胞子集的基因特征，在这些子集中，mast 细胞（hM01）表达一系列独特的基因，比如说TPSAB1/2，CPA3，MS4A2和KIT。与肺癌相反，在肿瘤和正常粘膜中表现了相当的富集。这个与肠的菌群和炎症的调节维持结直肠癌的稳态的特性保持一致。

三个DC子集（hM02-hM04），浆细胞DC（pDC），cDC2和cDC1细胞，具有高表达的HLA-DRs和低表达的CD14，同样被辨认出来，并且进一步被特异的marker所区分LILRA4/LILRB4，CD1C/FCER1A和XCR1/BATF3。这些DC细胞在结直肠癌和正常粘膜中具有显著的富集。三个血样富集的种群（hM05-hM07）被分为经典的CD14hi CD16-, 非经典的CD14+CD16hi，以及中间状态的CD14hiCD16+的单个细胞。这些很大程度上和以前的报告是一致的。

剩余的种群被认为是巨噬细胞，根据他们高表达CD68，CD163和MRC1。在他们中间，种群显示了相当的（hM08）或者偏好性的富集（hM09和hM10）在正常的粘膜中，相比较肿瘤，认为是组织特异的巨噬细胞。然而剩余的肿瘤富集的种群肿瘤有关的巨噬细胞（hM12-hM13），促炎细胞因子基因，IL1B，在组织特异的巨噬细胞中发现，而且NLRP3+的巨噬细胞显示出较高的表达量。与nlrp3炎性小体激活il -1P调控肠内稳态中的作用一致。然而表达NLRP3+和PLTP+的组织特异的巨噬细胞显示出了更低的HLA-DR基因的表达量相比较IL1B+的组织特异的巨噬细胞，这个PLTP+的巨噬细胞显示出特异的表达LYVE1和IL10，与最近报道的Lyve1hi MHCiiio 单个核的组织特异的巨噬细胞相似，这种细胞在抑制炎症和纤维化方面有重要作用。

3 TAMs Mainly Develop from Unique Tumor-Infiltrating Monocyte-like Precursors

最近的在小鼠里的研究，已经暗示了肿瘤有关的巨噬细胞来源于RTMs（组织特异的巨噬细胞）或者最新招募单个核细胞仅而分化成巨噬细胞。利用RNA的velocity分析可以推断出一个细胞的未来命运，他们找到了一个非常强的进化轨迹，就是从CD14-表达的单个核细胞到FCN1+的单个核细胞，最后不同的巨噬细胞群。更值得注意的是肿瘤富集的FCN+单个核细胞显示出了和血液中的CD14+单个核细胞显示出很高的相似性，最有可能是一个单个核种群迁移到了肿瘤里面，具有了肿瘤特异的转录程序。

他们更进一步利用两个同源的算法，URD和PAGA去推测巨噬细胞的转录轨迹，暗示了FCN1+单核的细胞可以产生C1QC+和SPP1+的肿瘤有关的巨噬细胞通过不同的组织特异的巨噬细胞。有趣的是， C1QC的肿瘤有关的巨噬细胞与IL1B+的组织特异的巨噬细胞相互作用，所有的种群都会表达C1Q的补充成分。以及HLA-DR。值得注意的是IL1B+组织特异的巨噬细胞显示出展示出低表达的APOE和APOC1相比较C1QC+的肿瘤有关的巨噬细胞证明了这些细胞可以部分的和C1QC+肿瘤有关的巨噬细胞具有相似的功能表型。但是并没有更新转录组程序针对于肿瘤的反应。相反的，SPP1+的肿瘤有关的巨噬细胞主要和NLRP3+的组织有关的巨噬细胞相互作用，所有的cluster都低表达HLA-DRs。确实，一部分NLRP3+组织特异的巨噬细胞依然存在肿瘤中，暗示了他们可以在肿瘤微环境中转化成SPP1+的肿瘤有关的巨噬细胞，总的来说，他们的数据暗示了SPP1+和C1QC+肿瘤有关的巨噬细胞来源于单个核的肿瘤浸润的前体，然而SPP1+肿瘤有关的巨噬细胞可能来源于NLRP3+组织特异的巨噬细胞。而且在体外分化研究 在含氧量正常或者缺氧的条件下培养培养了CD14单个核细胞，加入在肿瘤有关种群中不同表达的细胞因子和生长因子，证明了IL-1b和VEGF家族可以上调MARCO的表达量（是SPP1+肿瘤有关的巨噬细胞的一个marker）在缺氧条件下，与以前的假说一致，这个肿瘤微环境可以促进肿瘤有关巨噬细胞的发展. 然而，完全的解释去阐明肿瘤细胞和正常细胞中复杂的巨噬细胞发展轨迹需要额外的体外细胞分化试验和体内的种回溯的研究。

4 Dichotomous Functional Phenotypes of TAMs in Human CRC

乳腺癌和肺癌的肿瘤有关的巨噬细胞显示了一个连续的表型，在肿瘤微环境里面。而在结直肠癌中出现了明显的两种类型，暗示了具有不同的细胞分化的路径，更重要的是所有的肿瘤有关的巨噬细胞表达不同的转录因子，一种是表达MAF/MAFB和FOS/JUN的C1QC+肿瘤有关的巨噬细胞，另一种是CEBPB和ZEB2的SPP1+的肿瘤有关的巨噬细胞，这个与发现两个子集的肿瘤有关的巨噬细胞被转录调控网络稳定的控制是一致的。基于TAMs（肿瘤有关的巨噬细胞）中经典活化(M1)和选择性活化(M2)巨噬细胞相关基因的表达分析(Azizi et al.， 2018)并不能解释在结直肠癌中发现的c1qc +TAM和spp1 +TAM的对立。

更进一步的比较这两群TAMs揭示了， TAMs显示了高水平表达的C1Q, TREM2, MERTK 和CD80。与此相反的是SPP1+的TAMs显示出了SPP1，MARCO，VEGFA的特异性表达。利用GSVA评价两个子集TAMs富集的pathways， 发现在SPP1+TAMs中富集肿瘤的血管生成，ECM受体相互作用，肿瘤血管的patways。在C1QC+ TAMs中 富集补体活化和抗原处理以及表达patways富集。更值得注意的是，SPP1+TAMs 额外显示了特异的结直肠癌和转移的肝癌的patways的富集。暗示了一个促肿瘤和促转移的角色在结直肠癌中。多个图像数据也证实了这两种TAMs子集的存在，通过各自表达，CD68，CD80，MAF和CD68，MARCO，VEGFA。而且只有C1QC+的TAMs可以在溃疡性结肠炎(UC)和健康人的结肠粘膜鉴定出来，然而SPP1+的TAM,s在非癌的组织中很不常见，暗示了结直肠癌的在肿瘤微环境中对立的功能表型。

5 TAM and cDC Subsets Comprise the Core of a Predicted Cell-Cell Interaction Network

为了研究在结直肠癌中细胞之间的相互作用，他们结合了单细胞的RNA-seq和TCGA的bulk RNA-seq数据集做了一个计算模型，这个是用的以前在癌症研究里的方法。除了找出基因和某一个特定的cluster呈现出很强的相关性，他们同时也找出那些从TCGA中找出来的高度相关的基因，并且把他们匹配到相应的单细胞RNA-seq的cluster上，然后推导出共同存在的特异的细胞类型。通过把富集在肿瘤里的所有的细胞子集都运用到电脑模型，他们建立了一个结直肠癌的细胞和细胞之间相互作用的网络。他们利用正常组织数据库GTEx的数据作了相似的分析。这些分析找出了在肿瘤中纤维细胞和内皮细胞之间的相互作用，以及在正常粘膜里卵泡B细胞和T卵泡辅助细胞(Tfh)的和相互作用。暗示了这种方法在罕见细胞类型找到具有生物学意义的相互作用的的应用。

在临近的正常粘膜，可以在B细胞，T细胞和DCs细胞之间看到相互作用，反映了在结直肠淋巴结中的相互作用。但是相反的是在肿瘤中发现了发现了不同的相互作用。TAMs和cDCs作为预测的网络的核心，与其他的细胞类型具有最多的联系。然而SPP1+TAMs显示了CAFs和肌成纤维细胞的相互作用，C1QC+TAMs和两个种群的cDCs主要和其他的免疫细胞相互作用。尤其是T细胞子集，暗示了其在调控抗肿瘤的T细胞反应。

为了推导分子间相互作用调控细胞和细胞之间的相互作用。他们利用单细胞RNA-seq数据计算了配体-受体对的吸引力，通过与以前的方法相似的模拟分析，确定了显示显著细胞群体特异性的数百对交互作用。在关于髓系细胞和T细胞的的配体和受体对立面，CXCL10-CXCR3显著富集在C1QC+TAMs，暗示了C1QC+TAMs在招募和激活T细胞方面潜在的作用。相比较C1QC TAMs和其他的白血球，SPP1TAMs更偏好表达SDC2，SDC2可以绑定到MMP2，MMP2可以在CAFs和内皮细胞中高表达，并且被报道在多个癌症类型中和肿瘤的生长和转移有关。其他的配体-受体对包含SPP1+TAMs 和其他细胞子集的相互作用， 包括SPP1-IT-GAV和FN1-ITGA5， SPP1+TAMs 表达高水平的SPP1和FN1。他们的分析暗示了SPP1和FN1也许和某些整合蛋白相互作用促进肿瘤的生成在结直肠癌中。总的来说，他们的单细胞RNA-seq数据暗示了TAMs和cDCs占据了细胞和细胞之间调控网络中心地位，TAMs也许起着相互对立的功能通过在结直肠癌的肿瘤微环境里，和不同的免疫和基地细胞相互作用。

6 Major Tumor-associated Myeloid Cell Populations Are Shared Between Human and Mouse

下一步，他们通过单细胞RNAseq数据探索了在小鼠的肿瘤模型中不同髓系细胞对抗肿瘤免疫的反应。以及把这些结果和人类的髓系细胞结合。他们发现两个治疗策略在临床实验中广泛探索，通过CSF1R的阻塞进行了TAM的消耗，以及通过CD40的兴奋剂完成DC的激活。他们首先在多个同基因小鼠肿瘤模型中评估这些治疗方法，确定Renca肿瘤的生长对抗csf1r阻滞剂抗体敏感，MC38的生长对抗cd40激动剂抗体敏感。基于这些发现，多个单细胞的单细胞RNA-seq的研究利用10X的基因组平台在免疫细胞上，这些免疫细胞要么是经过anti-CSF1R的治疗后的Renca 肿瘤中分离出来，要么是经过anti-CD40治疗的MC38肿瘤或者肿瘤。

Graph-based的聚类被用来找出主要的免疫细胞类型，包括在renca和MC38 单细胞RNAseq的T细胞和髓系细胞。为了更好地比较肿瘤相关的小鼠骨髓细胞亚群和人类骨髓细胞亚群，我们接下来整合并聚集了来自这两种模型的骨髓细胞，确定了15个离散细胞簇(图3G)。每个簇与一种独特的基因表达模式相关，表明一种不同的细胞类型(图S6E)，而簇在mc38和Renca肿瘤中都被大量识别(图S6F)。为了识别人与小鼠种群之间的关系，我们进行了系统相似性分析，识别跨物种的多个相应的髓系种群。

首先聚焦于cDC种群，他们找出两种小鼠的cDC1子集（mM06和mM07），他们都比对到人类CRC的单个cDC1的cluster里面（hM04）， 更进一步的评价BATF3+cDC1种群细胞的异质性通过再次聚类， 找到了在人类中，出现所有表型的cDC1证据。更值得注意的是这两种cDC1细胞表型与已知的未成熟的和激活的cDC1细胞类似。以及最近描述的在人类和小鼠的肿瘤中都有激活的LAMP3+CCR7+DCs。他们同时在小鼠中找到了2个cDC2分型比对到人类的结直肠癌的cDC2上。值得注意的是itgax+cDC2种群最有可能代表一个经典的cDC2子群，然而Cd209a+cDC2集群与单细胞来源的树突状细胞具有相同的特征，这些树突状细胞可能与新浸润的血液单核细胞不同。

与DC群体相比，TAMs在小鼠和人类之间表现出更大程度的表型异质性，这与最近在肺癌方面的观察结果一致(Zilionis等，2019)。然而，小鼠巨噬细胞簇(mM11-mM14)与人类的C1QC+TAMs的相似性最高，与人类的SPP1+TAMs具有最小化的重叠的基因表达最高。相比之下，小鼠巨噬细胞簇mm15_macro vegfa 与人类的SPP1+TAMs具有极大的相似性(图3H)。对小鼠TAM亚群进行与人类TAM集群相似的通路分析(图3B)，我们发现小鼠TAM种群也根据其血管生成、缺氧和T细胞相互作用基因信号分群(图4A)。这些数据表明，在人类CRC患者和小鼠肿瘤模型之间存在功能上类似的TAM人群。我们还在小鼠肿瘤中发现了两个cDC2簇(mM04和mM05)，它们在人类CRC (hM03)中映射为一个单一的dc2群体(图3H)。值得注意的是，itgax +cDC2集群可能代表了经典的cDC2亚群，其中cd209a +cDC2集群与单细胞来源的树突状细胞具有相同的特征，可能与新浸润的血液单核细胞不同。

7 A Pro-Angiogenic Macrophage Population Is Resistantto Therapeutic Treatment with Anti-CSF1R Blockade

接下来，我们试图阐明抗csf1r对小鼠TAM种群的影响，并将这些发现与人类相应的人群联系起来。正如预期的那样，与对照组抗体相比，抗csf1r治疗renca肿瘤小鼠的tams频率降低(图4B)。然而，抗csf1r治疗后仍有可检测到的TAMs人群。对这个抗csf1r耐药群体的进一步评估显示，F4/80高水平表达的巨噬体优先减少(图S7A S7D)，这表明不同巨噬细胞群体对抗csf1r治疗的敏感性差异。与这些发现相一致的是，对来自Renca肿瘤的scRNA-seq数据的分析显示了在抗csf1r治疗后，细胞群体mM12和mM14几乎完全丧失，但TAM种群mM11、mM13和mM15的减少极少(图4C和4D)。的确，在抗csf1r处理组中，某些集群的频率增加了(图4D)，这可能是由于免疫细胞总数中大量噬菌体数量的减少所致。我们进一步研究了TAM人群对抗csf1r治疗的敏感性差异如何改变TME。我们发现抗csf1r耐药的TAMs优先表达涉及血管生成的基因，如促进血管生成和免疫抑制的基因，如cd274和arg1(图4E)。值得注意的是，抗csf1r治疗后肿瘤中的巨噬细胞似乎也优先与肿瘤血管系统相关(图4F)(DeNardo et al.， 2011)，提示其在调节血管生成过程中发挥作用。

考虑到CSF1R信号在控制巨噬细胞稳态中的作用(Hume et al.， 2019)，我们接下来评估了巨噬细胞增殖是否与抗csf1r治疗的敏感性相关。与耐药群体(mM11、mM13、mM15)相比，抗csf1敏感群体(mM12、mM14) mki67表达升高，增殖评分也更高(图4e和4G)。值得注意的是，在人类肿瘤中，C1QC+TAMs的增殖评分也高于spp1 +TAMs(图4H)。这些数据表明，在小鼠中，CSF1R封锁导致细胞周期中巨噬细胞的优先消耗，导致这种治疗在TAM亚群中的不同效果。将这些发现外推到人类身上，CSF1R封锁可能优先耗尽1qc +TAM子集的一部分，而spp1 +TAMs则较少。为了进一步将我们在小鼠中的研究结果与人类CRC相关联，我们比较了具有不同c1qc +TAM和spp1 +TAM基因特征水平的个体的患者生存率，发现在CRC患者中，低C1QC+TAM和高SPP1+TAM基因特征组合与较差的预后结果相关(图4I)。这些发现表明，抗csf1r治疗可能不足以耗尽具有肿瘤生长促进潜能的巨噬细胞群体，这一特性可能是在Renca小鼠肿瘤模型和人类癌症患者中抗csf1r单药治疗效果不佳的原因。

8 Early Specific Amplification of a cDC1 Population uponAnti-CD40 Treatment

接下来，我们重点分析了抗cd40激活剂治疗的机制。用抗cd40药物治疗MC38肿瘤小鼠可导致肿瘤生长下降(图S6A)，而结合PD1阻断后肿瘤生长进一步增强(图5A和5B)。对人类crc和小鼠MC38肿瘤样本的scRNA-seq分析显示，CD40可在多个DC和巨噬细胞亚群上释放，尤其是cdc1簇(图5C和5D)。与这些发现和我们的细胞-细胞相互作用网络分析(图3E)一致，显示了cDCs与各种T细胞的广泛相互作用亚群(图5E和表S4B)，我们发现cd40 lgb在人和小鼠肿瘤的多个CD4+T细胞簇上高表达(图5C和5D)。虽然已知CD40/CD40LG通路可调节髓系细胞和T细胞之间的相互作用(Grewal和Flavell, 1998)，但我们的目标是识别特异性的髓系和T细胞亚群，这些亚群优先受到CD40激活作用的影响。治疗后不同时间点的scRNA-seq数据分析显示，抗cd40激活剂介导的ccl22 +cDC1细胞频率增强，而其他dc亚群在治疗后第2天或减少或不变(图5F)。抗cd40抗体也显著激活cDC1细胞，CD80和cd86表达升高(图5G和5H)。此外，抗cd40增加了cDC1细胞IL-12的生成(图5I)， IL-12是一种细胞基元，可以增强CD8+T细胞的Th1发育和IFNgproduction (Tait Wojno et al.， 2019)。虽然抗cd40抗体对TAMs的影响不太明显(图S7E)，但我们观察到mafb +TAMs在治疗后第2天短暂降低，maf +TAMs在治疗后第10天显著降低(图S7E)，这可能反映了cd40激动剂治疗引起的广泛的肠相关免疫细胞频率的变化。因此，我们的scRNA-seq分析发现ccl22 +cDC1细胞是mc38模型中抗cd40抗体治疗后早期活化的主要骨髓细胞类型。重要的是，cdc1激活的签名基因与CRC患者良好的总体生存呈正相关(图5J)，提示抗cd40激活这些细胞的能力可能与人类癌症相关。

9 Anti-CD40 Treatment Increases Effector Memory CD8+T Cells and Induces the Activation and Expansion ofBhlhe40+Th1-like Cells in Tumor

接下来我们研究了抗cd40治疗对肿瘤浸润T细胞功能的影响。对MC38肿瘤模型T细胞的scRNA-seq分析(图S7F和S7G)表明，CD4+和CD8+T细胞亚群的频率受CD40激活剂治疗的影响(图6A)。由于我们也从scRNA-seq中捕获了TCRa-和b-链序列(表S6A)，因此我们使用之前开发的startrac指数来定义T细胞的克隆扩张、迁移和发育过渡(Zhang et al.， 2018)。抗cd40治疗显著增加了肿瘤记忆CD8+T细胞亚群的比例，但降低了耗尽CD8+T细胞亚群的频率，尤其是在治疗后10天(图6B)。此外，抗cd40治疗显著改变了衰竭标记inLag3+Tex和mki67 +Tex亚群的表达谱和动力学，ctla4和tigitbeing的表达在治疗后迅速减少，治疗后10天inpdcd1和lag3的表达显著减少(图6C)。流式细胞仪证实了这些scRNA-seq结果。抗cd40治疗在肿瘤中增加效应CD8+T细胞并恢复PD1+耗尽的CD8+T细胞(图6D 6G)。通过STAR TRAC分析，我们发现在抗cd40处理下，ccl5 +Tem CD8+T细胞比其他CD8+T细胞亚群具有更高的迁移指数(图S7H)，这与我们之前的研究结果一致，即CD8+Tem细胞比Trm或耗尽的CD8+T细胞更具迁移性(Zhang et al.， 2018)。的确，抗cd40治疗显著增加了tdLNs中ccl5 +Tem CD8+T细胞的比例，但没有增加theCxcr6+Trm的数量(图S7I)。进一步解剖ccl5 +Tem亚群的TCR克隆类型，发现克隆扩张率高的细胞在肿瘤和tdLN中表现出更多的TCR共享，表明这些细胞supon抗cd40处理具有更强的流动性(图6H、6I、S7J和表S6B)。此外,过渡指数betweenCcl5 + Tem andCxcr6 + Trm CD8 + T细胞明显高于其他pairsamong CD8 + T细胞在基线子集,这表明certainCxcr6 + Trm肿瘤细胞可能来源于infiltratedCcl5 + Tem细胞,在这一过程被anti-CD40进一步提高治疗(图6 j)。总之，我们的数据揭示了抗cd40治疗对肿瘤浸润的Tem和Trm CD8+T细胞的扩张、迁移和转移的独特作用。我们发现CD40激动剂治疗对肿瘤浸润的CD4+T细胞亚群也有显著影响。虽然在抗cd40处理后2天，Treg细胞显著扩增，但与对照组相比，抗cd40处理后10天，Treg细胞比例降低(图7A)。starclock -expansion index证实，抗cd40处理在第2天增强了Treg的扩张，第10天限制了Treg的扩张(图7B)。相反，抗cd40治疗在第2天和第10天特异地增加了bhlhe40 + th1样细胞的比例，这被抗cd40触发的细胞在第2天和第10天的克隆扩张证实(图7B)。有趣的是，在我们的scRNA-seq数据集中，我们发现抗cd40处理显著诱导cd40lgonbhlhe40 + th1样细胞的表达(图7C和7D)，流式细胞术分析证实了这一发现(图7E)。这些数据表明，CD40激动剂可能能够进一步增强肿瘤相关bhlhe40 + th1样细胞和cDC1细胞的存活。我们之前发现ifgn -表达bhlhe40 + th1样细胞在MSI CRC患者人群中富集，显示出对ICB治疗的良好反应(Le et al.， 2015;Zhanget。,2018)。我们证实，从小鼠MC38肿瘤分离的bhlhe40 +CD4+T细胞也表达较高的erbhlhe40(图S7K)，与其他效应CD4+T细胞相比，ifng40的产生显著增加(图7F和7G)，流式细胞仪表达了增殖标记Ki67，并通过抗cd40处理进一步诱导增殖(图7H)。因此，肿瘤cDC1细胞的抗cd40激活可能导致产生ifng的肿瘤浸润CD4+Th细胞的频率增加。与这一假设相一致的是，在玻璃化研究中，抗cd40处理促进DC成熟，进一步增加了CD4+T细胞中bhlhe40的表达，但在不理想的抗原浓度刺激下，却不能增加bx21的表达(图7I和s7l - s7m)。进一步分析人类CRC患者中ofifng表达bhlhe40 + th1样细胞与cDC细胞的相关性，发现th1样细胞的基因标记与成熟和未成熟cDC1细胞优先呈正相关。这些cDC1细胞在MSI-H CRC患者中也显著富集(图7J)，可见cDC1细胞与bhlhe40 + th1样细胞之间存在联系。重要的是，我们发现抗CD40增加了bhlhe40 + th1样细胞存活，这可能为为什么在这个模型中CD40激活剂能够成功地与抗pd1协同提供了机制解释(图5A和5B)。

DISCUSSION

在这里，我们利用了两个scRNA-seq 方法的优势，生成了人类CRC患者的免疫和非免疫细胞图谱。将这些细胞分类并推断出细胞-细胞相互作用网络(图8a)，揭示了特定的骨髓细胞群作为相互作用的中心节点，这使得我们关注它们在人类和临床前小鼠肿瘤模型中的功能(图S8B和S8C)。与淋巴细胞、间质和DC亚群在不同组织和癌症类型中的相对稳定表型不同，巨噬细胞的独特特征似乎依赖于其组织/肿瘤来源(Azizi et al.， 2018;Chev-rier等人，2017年;Lambrechts等，2018年;Lavin等人，2017年;Ven-teicher等人，2017;Zilionis等，2019)。而TAMs在乳腺癌和肺癌患者中呈连续光谱pheno型(Azizi et al.， 2018;Lambrechts等，2018)，在本研究中，我们在CRC中鉴定了两个不同的TAM群体，包括c1qc +和spp1 +TAMs，两者都可能来自肿瘤中cn1 +单核细胞样细胞的中间介导状态。与之前的研究一致，这两个种群都不符合m1和M2二分表型(Azizi et al.， 2018;Mu ller等，2017)。C1QC+TAMs优先表达吞噬和抗原提呈相关基因，而espp1 +TAMs富集调控血管生成。与健康供体的正常粘膜相比，只有spp1 +TAMs在肿瘤中表现出优先富集，这表明它们在CRC的肿瘤发生中起着关键作用。消耗免疫抑制TAMs是一种有吸引力的促进抗肿瘤免疫反应的标致方法。然而，它们的异质性，不同的功能，和预测的细胞-细胞相互作用模式需要更多的亚群特定策略。事实上，尽管CSF1R阻断可能导致显著的TAM损耗，但CSF1R抑制作为单一疗法在癌症患者中提供了极少的治疗效益(Papa-dopoulos等，2017;Ries等，2014)。最近的数据表明多种代偿机制可能限制CSF1R阻断的抗肿瘤作用，包括治疗诱导的oxp3+ treg或骨髓来源的抑制细胞移植(Gyori等，2018;以及巨噬细胞依赖替代信号招募、促活和/或存活的能力(Neubert等，2018;Pradel et al ., 2016)。我们的数据识别了小鼠TAM亚群，这些亚群都是通过抗csf1r再破裂到消耗，并且与具有促血管生成特征的ho - manspp1 +TAMs相似，并且基于预测的细胞-细胞相互作用网络，可能与CAFs和内皮细胞发生engagein串语。因此，这一群体的持续存在以及炎性原细胞yc1qc + tampopulation的缺失，可能代表了一种以前未被认识的机制，即通过抗csf1r治疗对巨噬细胞不加选择的缺失产生抵抗。考虑到高spp1 +和低c1qc +TAM标记的患者预后不良，我们的研究结果表明，spp1 +TAMs的特异性缺失可能最终导致骨髓靶向免疫治疗或增强联合ICB治疗的改善。理解DC子类型的重要性也同样得到了证明。在经scRNA-seq鉴定的mc38和Renca小鼠肿瘤中的cDC1亚群中，只有一个(mM06)表达经典的cDC1标记物sclec9aandxcr1。相比之下，Ccl22+cDC1s (mM07)与最近其他人报道的人crc和肿瘤相关的LAMP3+ dc中的cDC1细胞的cd40 +CCR7+LAMP3+亚群具有相似性(Zhang等，2019;Zilionis等，2019)。之前的研究表明，小鼠cDC1细胞在成熟或活化时下调excr1和clec9a的表达(Ardouin et al.， 2016;Merad et al.， 2013)提出，ccl22 +cDC1细胞可能被cDC1激活，而不是发育上不同的亚群。重要的是，CD40激动剂治疗显著增加了mc38肿瘤中ccl22 +cDC1细胞的频率，而对其他骨髓亚群没有显著影响，这表明CD40激动剂优先靶向这些活化的dc以促进抗肿瘤免疫反应。我们的人类细胞-细胞相互作用分析预测了batf3 +cDC1群体与耗尽的CD8+T细胞以及bhlhe40 + th1样细胞的不同群体之间的未被预测的相互作用。虽然我们没有观察到在抗cd40治疗后耗尽的CD8+T细胞频率的显著变化，但几种抑制受体如PD-1的表达水平降低了。有趣的是，bhlhe40 + th1样CD4+T细胞与在MSI CRC中发现的细胞细胞类似(Zhang et al.， 2018)，在抗cd40治疗之前，观察到在记忆性CD8+T细胞频率增加之前，bhlhe40 + th1样CD4+T细胞快速扩增。考虑到cd40介导的acti-通过观察cd40介导的cDC1激活、Bhlhe40+ th1样CD4+T细胞扩增和记忆CD8+T细胞浸润等体内不同免疫细胞的激活动力学，我们推测Bhlhe40+ th1样CD4+T细胞的扩增可能是ccl22 +cDC1激活的下游。这些ebhlhe40 +T细胞可能通过向cDC1细胞(部分通过cd40lg表达)提供正反馈信号，增强cDC1介导的cd8 +T细胞的浸润、扩张和抗肿瘤功能。虽然调节T细胞中bhlhe40表达的途径尚不清楚，但研究表明，活化的髓细胞产生的TCR激活和il - 1bh等细胞因子可能参与了bhlhe40的增殖(Lin et al.， 2016)，这提示了抗cd40可能促进bhlhe40 +T细胞生成的潜在机制。靶向细胞缺失研究将有助于进一步明确肿瘤内细胞相互作用(包括40激动剂介导的反应)的精确作用。然而，我们的研究提供了对cd40激动剂活性调控机制的深入理解，并进一步支持了bhlhe40 + th1样CD4+T细胞在抗肿瘤免疫和治疗中的重要性。综上所述,我们的研究揭示了以前不被接受的髓系-T细胞在CRC和myeloid-stromal连接,提供机械的见解免疫疗法在临床开发和演示的方法检测特定肿瘤相关的免疫的作用通过互补的单细胞分析野生人类和老鼠的肿瘤。此外，我们在交互式门户网站(http://crcleukocyte.cancer-pku.cn/)中提供的数据集，可作为进一步探索人类和小鼠肿瘤浸润免疫细胞的资源。