【附加篇】免疫荧光相关的注意事项

聊点学术

免疫荧光实验原理很简单，其实就是使用荧光二抗，并在荧光显微镜下采集图像，其它的和IHC或ICC区别不大。

但是，想要得到良好的结果却很难，大家经常会遇以下问题：

（1）目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果；

（2）蛋白荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果；

（3）DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色；

（4）组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色；

（5）采集图像过程不当，导致原始图像不佳，直接影响后续半定量分析。

可以看出，无论是荧光太强或者太弱，都会造成免疫荧光实验结果差或者失败。绝对消除影响是做不到的，希望大家能认识到这一点。针对这些问题，我们只能尽可能地优化，减弱影响。

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接下来，只讲干货

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问题分析：

（1）目标蛋白的荧光很弱，导致组间差异并不明显，造成假阴性结果

这种情况出现后，首先要检查一下抗体对不对，是否适用于你的预处理组织。一个典型的例子就是，有些抗体只适用于冰冻切片，但若将其应用于石蜡切片，就会造成弱标记或无标记现象。

然后通过文献等查找一下目标蛋白在该组织或细胞的表达丰度如何。若该蛋白本身表达就很少，那就没啥可说的，你的结果应该没问题。

此外，如果抗体修复不充分，抗原表位未完全暴露，也会出现弱标记现象。比如，尽管大多数抗体都是在酸性环境中修复，但是也存在少量的抗体需要在碱性环境中修复，建议查看抗体说明书，严格按照其修复条件进行实验。

（2）目标蛋白的荧光太强，甚至形成非特异性的标记，一些背景染色可能被误认为阳性区域，造成假阳性结果

这种情况一般出现在抗体浓度过高而漂洗又不充分的时候。多余的抗体会吸附在组织上，造成荧光图像整体高背景。

改进方法是适当降低一抗或者二抗的浓度，增加漂洗时间，一般能够有所改善。

（3）DAPI染细胞核时，加入的试剂太多，造成高背景染色

现在都是使用的防荧光衰减DAPI试剂，使用时滴上一滴就能将细胞核标记。

但是这也带来一个小问题。滴加的量太多时，会造成整张图像呈现出蓝色的背景。采集得到的图像会很不好看，如果单纯使用γ值曲线去调整，图像中的细胞核会呈现出假假的感觉，像是P上去的。

因此，滴加的DAPI不要太多，只需覆盖上薄薄的一层即可。事实上，个人认为只要切片没有暴露在自然光或者激发光之下，荧光的自然衰减并没有想象中那么快。

（4）组织切片预处理不当或采用石蜡切片，导致高背景染色

如果组织切片，尤其是石蜡切片脱蜡环节不彻底，也会造成区域性的非特异性标记。建议脱蜡一定要彻底，脱蜡前充分烤片也可以帮助脱蜡。

实验过程中，玻片干燥了，同样会造成高背景或大面积的非特异性标记。漂洗环节和抗体孵育环节最容易出现干片现象，尤其是大批量实验时，一定要注意。使用免疫组化专用笔画个圈，可以有效改善。

（5）采集图像过程不当，导致原始图像不佳，直接影响后续半定量分析

采集图像时不要对每一张图像都加上标尺，否则后期采用Image J或者IPP进行分析时，这些标尺会对结果造成影响。

采集图像时，速度要快。如果激发光很长时间对准目标区域，此区域内的荧光衰减会极快，有经验的人都知道，不必多说。因此，目标区域较小时，一定要尽量快速采集，减少人为实验误差。

采集图像时，必须固定一个γ值，不可以在采集过程中修改。因为，γ值确实可以改善图像的某些瑕疵，但是这样一来，图像的荧光分布和强度会受到γ值的极大影响。调整幅度太大，更会造成荧光假假的感觉，非常失真。

当然了，后期半定量分析时，如果一定要调整γ值，那也是对整批次图像的统一调整，而不是某几张图像。千万别走入造假的险境之中。