最基本的生信套路换了miRNA也能发6分+

百味科研芝士

发布于 2021-01-06 14:45:52

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发布于 2021-01-06 14:45:52

大家好！今天跟大家分享的是2020年12月发表在Genomics（IF = 6.205）上的文章。文章利用了从TCGA数据库中搜集的头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）RNA测序数据和miRNA测序数据进行了综合分析，通过与临床数据结合，利用Cox回归分析，得到了7个与HNSCC相关的标志性miRNA，确定为用于头颈部鳞状细胞癌预后的新型miRNA标志物。

题目：miRNA biomarkers for predicting overall survival outcomes for head and neck squamous cell carcinoma

miRNA生物标志物可预测头颈部鳞状细胞癌的总体生存结果

摘要

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是上消化道恶性肿瘤。miRNA功能的增加或者减少可通过多种机制促进癌症的发展。本文利用来自TCGA数据库的RNA测序（RNA-seq）和miRNA测序数据显示功能异常的miRNA微环境，并可以为miRNA治疗提供有用的生物标记。在训练集中，发现7个miRNA是HNSCC患者的独立预后因素。这些miRNA共有60个预测靶基因，其中 9个靶基因（CDCA4，CXCL14，FLNC，KLF7，NBEAL2，P4HA1，PFKM，PFN2和SEPPINE1）与患者的总生存期（OS）相关。本文确定了用于预测头颈部鳞状细胞癌预后的新型miRNA标志物。

流程图

1. 数据的获取和整理

从TCGA数据库中下载HNSCC患者的RNA-seq数据和miRNAs-seq数据。miRBase数据库包含已知miRNA序列和注释，其中有成熟miRNA的位置和序列的信息。从miRbase获得的所有成熟miRNA序列的Fasta格式序列用于miRNA注释。分别从529名（42名正常和487名肿瘤）和552名（44名正常和508名肿瘤）患者的样本中提取RNA-seq数据和miRNAs-seq数据。同时收集的临床病理数据包括性别，年龄，分期，TMN分类，生存状况和生存天数。

2. 建立基于miRNA的预后标记

从TCGA的组学数据中分析共得到1075个差异表达的mRNA（上调581个，下调494个）以及miRNA 313个差异表达（上调203个，下调110个）。图1A-1B显示了前20个上调/下调表达差异mRNA的热图和火山图，图1C-1D显示了前20个上调/下调表达差异miRNA的热图和火山图。为了筛选预后的miRNA，利用单变量COX分析评估了差异表达的miRNA。在单变量COX分析中发现重要的26个miRNA具有显著性变化，其中7个差异表达的miRNA（hsa-miR-499a-5p，hsa-miR-99a-5p，hsa-miR-337-3p，hsa-miR-4746-5p，hsa-miR-432-5p，hsa -miR-142-3p，hsa-miR-137-3p）是HNSCC患者的独立预后因素。因此，本文模型的公式为：风险评分=（0.238×hsa-miR-337-3p）+（0.246×hsa-miR-99a-5p）-（0.232×hsa-miR-4746-5p）-（0.233×hsa-miR-432-5p）-（0.261×hsa-miR-142-3p）。此外，本文还计算了研究集中每位患者的风险评分。然后，将中位风险评分作为训练集，测试集和所有患者中的分界值，将患者分为高风险组和低风险组。

图1.前20个上调/下调差异表达基因或miRNA的火山图和热图。

A-B：mRNA；C-D：miRNA。

3. 生存结果和多变量分析

本文通过使用KM生存曲线分析了7种miRNA在患者生存中的表达。发现hsa-miR-499a-5p，hsa-miR-99a-5p，hsa-miR-337-3p，hsa-miR-4746-5p，hsa-miR-432-5p，hsa-miR-142-3p和hsa-miR-137-3p显著影响OS结局（图2A-G）。此外，两个数据集的KM生存曲线可用于检测7个miRNA的预测值。在训练集和测试集中，高风险组的患者生存率均比低风险组低。利用ROC曲线研究生存相关miRNA的表达模式是否可以为HNSCC的发生提供早期预测。结果发现在训练集的AUC为0.716，测试集的AUC为0.654，说明该预后模型的敏感性和特异性是中等的。患者的风险生存状况图显示，随着患者的风险评分增加，死亡率也增加（图3）。为了建立基于7-miRNA的预后模型，本文使用单变量和多变量COX分析来识别风险因素，结果发现基于7-miRNA的特征，性别和N期是OS的独立预后因素（图4）。

图2. 7个miRNA训练集和测试集的总体生存分析。

A-G：miRNA；H：训练集；I：测试集。

图3.训练集和测试集的ROC曲线和患者的风险生存状态图。

A：训练集的ROC曲线；B：测试集中的ROC曲线；C：训练集中的生存状态；D：测试集中的生存状态。

图4.单变量和多变量COX分析以识别风险因素。

A：单变量；B：多变量。

4. miRNA靶基因分析

利用在线数据库预测得到了这7个miRNA的60个靶基因。通过Cytoscape探索miRNA与靶基因之间的潜在联系。如图5所示，hsa-miR-137-3p是网络中最大的节点，而hsa-miR-99a-5p和hsa-miR-4746-5p没有匹配的靶基因（红色点表示上调，绿色点表示下调）。为了评估这些靶基因的生物学功能，使用GO富集和KEGG生物学通路进行分析。GO分析显示：靶基因的生物过程（BP）在细胞功能负向调节，组织发育和对抑制因子的反应等条目中富集。分子功能（MF）在细胞外基质结构成分，生长因子结合，纤连蛋白结合和蛋白质酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性上富集，而细胞组分（CC）主要富集在血小板α颗粒，浓缩染色体动粒，细胞外基质等条目上。KEGG生物学通路分析表明，这些靶基因主要富集在磷酸戊糖通路，半乳糖代谢和糖酵解/糖异生通路中（图6）。

图5. Cytoscape可视化miRNA与靶基因之间的潜在联系。

图6.靶基因的GO分析和KEGG分析结果。

5. miRNA靶基因与生存情况的关系

分析miRNA靶基因表达对患者生存的影响，发现9种基因的表达：CDCA4，CXCL14，FLNC，KLF7，NBEAL2，P4HA1，PFKM，PFN2和SEPPINE1对OS产生了显著影响（图7A-7I）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建揭示了两个中心关键基因为PDGFRB和RAD51（图7J）。