如何制备pbmc

最近在学实验，和大家分享下。

先从制备pbmc开始吧。

pbmc 外周血单个核细胞 英文全称Peripheralblood mononuclear cell，注意这里并非单指单核细胞

全血由血浆和血细胞组成，我们的目标是拿到pbmc做后续实验。

我们的原理是利用梯度密度离心法制备。

血浆、pbmc和红细胞等的密度不同，加上淋巴细胞分离液，离心后全血分层，拿到上清液。

其分离原理是根据血细胞的密度差异（红细胞和粒细胞密度为1.090 g/mL左右；淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/mL；血小板为1.030~1.035 g/mL），通过离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将淋巴细胞从人外周血或脐带血中分离出来。

而我们使用的淋巴细胞分离液是1.077g/mL，介于红细胞和淋巴细胞之间。

具体步骤如下：以5ml全血为例

取5ml新鲜外周血（EDTA抗凝管）

取两个离心管，注满下层（约3-4ml），上层分别加入2.5ml全血

室温离心 1000g*10min （最佳离心条件需要摸索）

离心后血液分层，从上往下依次是血浆层、淋巴细胞层、淋巴细胞分离液层及红细胞层，我们要的是淋巴细胞层。

用枪把淋巴细胞层及上层液吸出来，如果有分隔的话，也可以直接倒出来。

离心 500g*4min

弃上清，加入红细胞裂解液1ml*5min，后加入等量中和液

离心 500g*4min

弃上清，加入细胞冻存液1ml重悬（10%DMSO+90%胎牛血清），后置于冻存管中

各取10ul液体，计数，看细胞活度，一般来讲细胞数量能达到106，细胞活度能90%以上

将冻存管置于梯度冻存盒中，放到-80℃冰箱

注意事项：

抽取的外周血，应尽快制备（尽量2h以内），且减少晃动

加入淋巴细胞分离液时，下层应尽量避免气泡的产生

裂红时间要足够；若裂红离心后下层沉淀仍有红色，应再次裂红

提前将梯度冻存盒置于室温，尽快将冻存管置于-80℃

刚开始做基础实验，希望和大家多多交流。