JMC综述推荐 | RING-type E3泛素连接酶抑制剂：进展、机遇和挑战

泛素蛋白酶体途径（UPS）是已知的所有真核生物体内具有高度选择性的蛋白质降解途径，该途径具体包括：首先在ATP供能的情况下泛素激活酶E1激活泛素，然后将其转移到泛素结合酶E2上通过硫酯键与E2的活性位点的Cys相连。E2可以直接将泛素转移到靶蛋白的Lys残基上，但整个泛素化过程中最关键的是需要一个特异的泛素连接酶E3将泛素与同源底物偶联。

泛素连接酶E3决定靶蛋白的特异性识别，在泛素途径中具有重要的作用。泛素连接酶E3通过调控调节蛋白的泛素化过程参与细胞内的多种生理过程。所有的E3都具有连接靶蛋白和特定E2的能力。蛋白质特定的翻译后的修饰经常作为其相应的泛素连接酶E3识别的标志。目前人类基因组编码的E3泛素连接酶超过600多种，主要分为两大类：HECT结构域家族和RING结构域家族。HECT结构域主要是通过与泛素形成催化作用所必需的硫酯键发挥作用，而RING结构域为E2和底物提供居留位点从而使E2催化泛素转移到底物上，由于具有同源保守的CUL结构域，因此也被称作Cullin-RING E3泛素连接酶（CRLs）。

近日，Genentech公司研究团队针对RING-E3连接酶抑制剂在药物化学方面的研究进展以及面临的机遇和挑战做了详细的总结，发表在药物化学权威期刊Journal of Medicinal Chemistry。

RING结构域家族最典型的特点是具有环指结构域(Ring finger domain)，每一环指结构域连有两个锌离子。RING E3s的E3活性依赖于环指结构域，并通过其与泛素结合酶E2相连。RING E3S家族包括大量成员，如：原癌基因c—Cbl、SCF、APC和一些IAP家族成员等。它们具有同时结合底物和泛素结合酶E2的能力，可以单独发挥作用。在这些蛋白质中，IAP和MDM2一直是药物研发的重点，已有多种相关抑制剂进入临床试验。

凋亡蛋白抑制剂（IAP）

凋亡蛋白抑制剂包括细胞凋亡抑制剂（cIAP1/2）和X-连锁凋亡抑制剂(XIAP)，两类蛋白具体结构组成如下图：

在这些结构域中，BIR3中的SMAC/DIABLO结合口袋被研究的最为彻底，是最具吸引力的抗肿瘤靶标。包括基因泰克、诺华在内的众多制药公司都有进入临床期的选择性BIR3抑制剂。基于Smac N结构域的结构设计已成为开发该类小分子抑制剂的最常用策略。Smac N端的前四个残基（AVPI）构成了主要结合口袋（Smac Kd = 420 nM，AVPI Kd = 580 nM）。大多数针对Smac设计模拟物的早期研究，重点是优化范德华力相互作用和抑制剂的理化性质以增加通透性。并总结出一些重要的构效关系（如下图所示）。单甲基化伯胺是可以耐受的，而双甲基化不行。这种修饰可适度改善细胞的通透性。因为这是一个相对较小的亲脂性口袋，所以甲基或乙基提供最佳的效力。异丙基侧链朝向溶剂区，被疏水性芳基基团取代可以提高抑制活性。由于缺少了与Gln主链的关键氢键相互作用， NH基团的甲基化显然不利于效能。脯氨酸能够决定构象转变，因此脯氨酸很难被替换。

BIR3抑制剂类型主要包括：

①SMAC拟肽拮抗剂

②二价SMAC类似物

③共价抑制剂

在BIR3抑制剂研发过程中，对其他结构域尤其是BIR2的选择性是一项重要的评价指标，研发者也发现了一些针对BIR2选择性较好的抑制剂，它们可以通过与BIR2结合介导caspase-3 / 7调节的细胞凋亡通路，而无需激活NF-kB途径。

Sanford-Burnham的研究人员公开了一系列选择性的XIAP BIR2抑制剂，这些抑制剂是由受到Smac结构域的AVPI N末端的三肽衍生而来的。在整个优化过程中，起始化合物20对XIAP BIR2比XIAP BIR3表现出适度选择性（5.4倍），将C末端酰胺取代基从二苯甲基（20）更改为1-萘基（21）提供了一个对XIAP BIR2较BIR3选择性略微降低的类似物（3.4倍）。后将氨基酸从脯氨酸变为丙氨酸，BIR2选择性明显提高，如22所示（对XIAP BIR2的选择性是BIR3的22倍以上）。研究者推测骨架构象的变化以及靠近C末端取代基的BIR2与BIR3序列之间的差异有助于提高这些抑制剂的选择性。化合物22可增强TRAIL（肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体）介导的PPC-1前列腺癌细胞的死亡，从而具有较好的细胞渗透性和预期靶向作用。

另一类BIR2抑制剂类型主要是苯并氮卓类抑制剂，该类结构中N末端丙氨酸的N-甲基化和修饰苯并庚酮对活性提高是有利的。氮杂七元环上N-取代基的衍生确定了1-萘基取代对于效能和选择性而言是最佳的。值得注意的是，可以通过调节R1取代基来提高亲脂性的方式，进而达到提高活性的目的。

MDM2抑制剂

MDM2一直以来也是抗肿瘤药物研发领域中的热门靶点。它主要充当肿瘤抑制因子p53的负调控因子角色，p53是一种可以促进细胞凋亡的转录因子，暴露于应激信号后引起细胞周期停滞或细胞衰老。MDM2表达在约7％的人类肿瘤中改变或过表达。在正常情况下，p53和MDM2的水平通过自动调节反馈回路保持平衡，其中p53转录并控制MDM2的表达。同样地，MDM2也能够通过多种机制抑制p53：p53的单泛素化诱导核输出，p53的多泛素化目标蛋白酶体降解以及MDM2与p53的结合阻止了p53与DNA结合并充当转录因子的能力。从结构上讲，MDM2的E3泛素连接酶活性来自其C端RING手指结构域，MDM2的N末端通过α螺旋反式激活域与p53的N末端相互作用，从p53的反式激活域结合到肽的MDM2的结构域揭示了一个深的疏水性裂缝，包括Phe19，Trp23和Leu26等残基。另外观察到两个分子间氢键（p53-Phe19 /MDM2-Gln72，p53-Trp23 / MDM2-Leu54）。这些分子间相互作用表明，非肽类小分子可以抑制MDM2 / p-53相互作用。

MDM2抑制剂的最早突破来自罗氏公司研发的Nutlins，一类带有顺式咪唑啉的系列抑制剂，其中32,33体外活性表现最好（IC50 分别为88和18 nM）。晶体结构表明4-氯苯基几乎完全与Trp23和Leu26形成的口袋形状互补，并且异丙氧基指向Phe19口袋。顺式-芳基环的4位上的卤素用于填充未被p53占据的小口袋。值得注意的是，抑制剂与MDM2结合位点的残基作用里没有氢键相互作用。研究者认为，咪唑啉骨架的刚性使其具有独特的能力来模仿螺旋肽对侧链的影响从而具备抑制活性。

在此之后，许多课题组相继报道几十种结构新颖、活性改善的MDM2抑制剂和共晶结构，进一步填补了该靶点在药物化学领域中的空白。

①螺羟吲哚类

②哌啶酮类

③异喹啉酮类

CRL1-Skp2抑制剂

E3连接酶除单独作用外，也能够相互之间形成复合体介导多种蛋白的泛素依赖性降解，包括细胞周期蛋白依赖性激酶（Skp2），p27，p21和p57。其中最受研究和关注的是p27，它与CDK结合并抑制CDK的催化功能，从而促进细胞周期停滞。遗传研究表明，降低p27的水平可以促进肿瘤的形成。例如Skp2的水平升高和p27的水平降低在许多类型的癌症中很常见。多项研究支持p27低水平与更高的肿瘤等级和不良的生存率相关。因此，通过抑制CRL1-Skp2复合体来稳定p27被认为是治疗癌症患者的一种较有潜力的研究思路。

如图所示，衔接子蛋白Skp1（所有SCF E3的共同接点）负责Cullin-1和Skp2的结合，后者被F-box共有域识别。第二个辅助蛋白Cks1（细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1）与Skp2相互作用，它们共同构成底物结合域，负责识别磷酸化的蛋白质，例如磷酸化p27。Cul1-Rbx1-Skp1-Skp2（F-box）的晶体结构如右图所示. CRL-Skp2的抑制可通过多种机制来实现，包括破坏Skp2-Skp1相互作用，Skp2-Cks1相互作用和底物（即p27）绑定。

目前关于这类抑制剂报道的为数不多，其中Wu等人详细介绍了虚拟筛选成功产生Skp2的E3连接酶功能抑制剂的方法。针对由Skp2-Cks1-p27晶体结构鉴定出的口袋启动了虚拟配体筛选。结构上不同的化合物“ C1，C2，C16和C20”结合在Skp2-Cks1界面的一个口袋中，从而阻断p27结合和泛素化（由免疫共沉淀实验支持）。尽管未获得共晶体结构，但定点诱变实验支持了可能的结合位点。尽管这些分子中的某些分子具有一致的PAINs雕刻性结构127，但化合物62-65在转移性黑色素瘤细胞系（501-Mel）的实验中显示出对p27水平和活力的剂量依赖性效应。这些化合物的优化尚未见报道。

“homo-PROTACs”

Ciulli等人设计了“ homo-PROTACs”降解VHL。通过将两种同源VHL粘合的双功能小分子通过Linker连接，目的是促进自身泛素化（反式）和VHL的降解。发现化合物CM11在低至10 nM的浓度下是pVHL30的有效降解剂。研究者通过实验证明了三元复合物的形成（VHL：CM11 = 2：1）.

总 结

选择性抑制泛素蛋白酶体途径的疾病相关成分仍然是临床前和临床研究的活跃领域。其中E3泛素连接酶超过600种，可以认为是UPS中最重要的选择性元素。这些E3酶可以将选择的E2酶与特定靶标相匹配。因此，在UPS内，靶向E3连接酶可以提供最精确（和安全）的方式来修饰特定靶蛋白的功能和稳定性。但迄今为止，只有少数针对单蛋白和多亚基RING E3泛素连接酶的研究产生了经过临床评估的小分子抑制剂。相信在对RING E3的结构充分理解的基础上，随着筛选技术的提高以及抑制机制的相应新发现，能够针对这种相对未开发的潜在靶标的取得更多成功。