Nat. Chem. Biol. | 使用生物感受器对蛋白激酶活性进行高分辨率成像

大家好，今天分享一篇发表在Nat. Chem. Biol上的文章。该文章的通讯作者是加利福尼亚大学的Jin Zhang教授和约翰霍普金斯大学的Richard L. Huganir教授。Jin Zhang课题组致力于研究蛋白激酶和磷酸酶功能调节的时空机制。Richard L. Huganir课题组致力于研究大脑功能和神经递质受体的调节。在这篇文章中，他们合作开发了超敏感的蛋白激酶A（PKA，Protein Kinase A）活性感受器（ExRai-AKAR2）。利用该感受器，他们实现了对活细胞以及小鼠大脑皮质中蛋白激酶A活性进行敏感快速监测。

PKA是一个重要的蛋白激酶，能够调控众多的细胞过程。近些年来，PKA在调控神经系统功能方面得到了越来越多的关注，比如调控突触可塑性和神经元兴奋性。利用生物感受器对PKA活性进行成像是研究PKA功能活性的一个重要方法，该方法能够获得更多PKA活性调节的细节信息，是研究PKA调控神经系统功能的有力工具。然而，以往的PKA活性成像系统存在敏感性低的问题，这限制了该技术的应用。在这篇文章中，作者基于之前的一代蛋白激酶A活性感受器，开发了超敏感的二代蛋白激酶A活性感受器（ExRai-AKAR2），该感受器在动态监测范围、信噪比和敏感性方面都有了很大的提升。

作者开发的蛋白激酶A活性感受器（ExRai-AKAR）是一种重组蛋白，主要分为三个结构域（上图所示）：（1）Substrate结构域（PKA能够特异性结合的氨基酸残基序列）；（2）荧光活性受别构调节的EGFP结构域；（3）FHA1结构域（可以结合带有磷酸化修饰的氨基酸残基）。当细胞内PKA识别该感受器的Substrate结构域后，会将其磷酸化，然后该感受器的FHA1结构域结合磷酸化的氨基酸残基，进而使该感受器发生别构调节，并使EGFP结构域具有荧光效应。在该文章中，作者主要是针对第一代蛋白激酶A活性感受器进行优化，并开发出效果更佳的第二代蛋白激酶A活性感受器，命名为ExRai-AKAR2。

首先，作者基于一代ExRai-AKAR，对其重要的氨基酸残基进行高通量优化筛选，并通过检测每一个突变体的荧光强度（ΔF/F）和比率（ΔR/R）变化量，最终筛选到一个性能最优的二代ExRai-AKAR2。然后，作者利用ExRai-AKAR2对PKA活性进行检测分析，发现其敏感性得到了显著提升。对亚细胞组分（脂膜、线粒体膜和内质网）中PKA活性检测表明，ExRai-AKAR2同样表现出优越的性能。并且发现，该感受器能够应用于流式细胞术、孔板荧光成像、单光子和双光子成像。作者对PKA活性、ERK活性和Ca2+信号进行同时成像分析，结果表明，上调的Ca2+信号会迅速激活PKA活性，而ERK信号则要在几分钟后才会激活，这提示了细胞内Ca2+-PKA-ERK信号通路的时序性激活。

利用该感受器，作者实现了对新生大鼠的心室肌细胞和原代海马神经元的PKA活性成像，并最终实现了对小鼠进行在体的PKA活性成像。

总之，ExRai-AKAR2是用来监测PKA活性的一种超敏感、可行的工具，特别是该工具可以利用到多种实验成像系统中，以及对小鼠进行体内的PKA活性监测。该研究对于深入阐明PKA活性的时空动态性大有帮助，并对开发其它蛋白激酶活性成像感受器也有借鉴意义。

本文作者：WWZ 原文连接：https://www.nature.com/articles/s41589-020-00660-y 原文引用：doi: 10.1038/s41589-020-00660-y 责任编辑：LBW