大家好,今天分享一篇发表在Nat. Chem. Biol上的文章。该文章的通讯作者是加利福尼亚大学的Jin Zhang教授和约翰霍普金斯大学的Richard L. Huganir教授。Jin Zhang课题组致力于研究蛋白激酶和磷酸酶功能调节的时空机制。Richard L. Huganir课题组致力于研究大脑功能和神经递质受体的调节。在这篇文章中,他们合作开发了超敏感的蛋白激酶A(PKA,Protein Kinase A)活性感受器(ExRai-AKAR2)。利用该感受器,他们实现了对活细胞以及小鼠大脑皮质中蛋白激酶A活性进行敏感快速监测。
PKA是一个重要的蛋白激酶,能够调控众多的细胞过程。近些年来,PKA在调控神经系统功能方面得到了越来越多的关注,比如调控突触可塑性和神经元兴奋性。利用生物感受器对PKA活性进行成像是研究PKA功能活性的一个重要方法,该方法能够获得更多PKA活性调节的细节信息,是研究PKA调控神经系统功能的有力工具。然而,以往的PKA活性成像系统存在敏感性低的问题,这限制了该技术的应用。在这篇文章中,作者基于之前的一代蛋白激酶A活性感受器,开发了超敏感的二代蛋白激酶A活性感受器(ExRai-AKAR2),该感受器在动态监测范围、信噪比和敏感性方面都有了很大的提升。
作者开发的蛋白激酶A活性感受器(ExRai-AKAR)是一种重组蛋白,主要分为三个结构域(上图所示):(1)Substrate结构域(PKA能够特异性结合的氨基酸残基序列);(2)荧光活性受别构调节的EGFP结构域;(3)FHA1结构域(可以结合带有磷酸化修饰的氨基酸残基)。当细胞内PKA识别该感受器的Substrate结构域后,会将其磷酸化,然后该感受器的FHA1结构域结合磷酸化的氨基酸残基,进而使该感受器发生别构调节,并使EGFP结构域具有荧光效应。在该文章中,作者主要是针对第一代蛋白激酶A活性感受器进行优化,并开发出效果更佳的第二代蛋白激酶A活性感受器,命名为ExRai-AKAR2。
首先,作者基于一代ExRai-AKAR,对其重要的氨基酸残基进行高通量优化筛选,并通过检测每一个突变体的荧光强度(ΔF/F)和比率(ΔR/R)变化量,最终筛选到一个性能最优的二代ExRai-AKAR2。然后,作者利用ExRai-AKAR2对PKA活性进行检测分析,发现其敏感性得到了显著提升。对亚细胞组分(脂膜、线粒体膜和内质网)中PKA活性检测表明,ExRai-AKAR2同样表现出优越的性能。并且发现,该感受器能够应用于流式细胞术、孔板荧光成像、单光子和双光子成像。作者对PKA活性、ERK活性和Ca2+信号进行同时成像分析,结果表明,上调的Ca2+信号会迅速激活PKA活性,而ERK信号则要在几分钟后才会激活,这提示了细胞内Ca2+-PKA-ERK信号通路的时序性激活。
利用该感受器,作者实现了对新生大鼠的心室肌细胞和原代海马神经元的PKA活性成像,并最终实现了对小鼠进行在体的PKA活性成像。
总之,ExRai-AKAR2是用来监测PKA活性的一种超敏感、可行的工具,特别是该工具可以利用到多种实验成像系统中,以及对小鼠进行体内的PKA活性监测。该研究对于深入阐明PKA活性的时空动态性大有帮助,并对开发其它蛋白激酶活性成像感受器也有借鉴意义。
本文作者:WWZ 原文连接:https://www.nature.com/articles/s41589-020-00660-y 原文引用:doi: 10.1038/s41589-020-00660-y 责任编辑:LBW