【生信文献200篇】09 PDGF-DD作用于NK细胞

00 文章信息

英文标题：Natural Killer Cells Control Tumor Growth by Sensing a Growth Factor

中文标题：自然杀伤细胞通过感知生长因子来控制肿瘤的生长

期刊：《Cell》

影响因子： 36.216 发表时间： 2018-01-25

研究领域：肿瘤信号通路

DOI号： https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.11.037

01 概述

通过筛选分泌组文库，作者发现人免疫受体NKp44可以识别PDGF-DD。PDGF-DD通过NKp44触发NK细胞分泌干扰素(IFN)-g和肿瘤坏死因子(TNF-a)，导致肿瘤细胞生长停滞。作者通过数据分析发现NCR2的表达、pdgf - dd诱导的NK细胞细胞因子基因的上调、肿瘤细胞周期基因的下调与胶质母细胞瘤(GBM)生存率的提高存在显著正相关。小鼠NK细胞中NKp44的表达比对照组小鼠更有效地控制了表达PDGF-DD的肿瘤的扩散，阻断抑制受体CD96或CpG-寡核苷酸治疗可增强这一效果。因此，当癌细胞产生PDGF-DD支持肿瘤生长和基质反应时，同时激活对肿瘤扩张的固有免疫反应。

02 背景

(PDGF)-DD： platelet-derived growth factor，通过自分泌和旁分泌 PDGFRβ 表达信号促进细胞增殖、上皮-间质转化、基质反应和血管生成。PDGF是血小板最早释放的一类生长因子，它的作用就是修复伤口，让伤口进行更好更完整的愈合。

The human NKp44 receptor (encoded by NCR2) is expressed by

• activated NK cells (Vitale et al., 1998)
• innate lymphoid cells of group 1 (ILC1) (Fuchs et al., 2013)
• innate lymphoid cells of group group 3 (ILC3) (Cella et al., 2009)
• plasmacytoid dendritic cells (Fuchs et al., 2005)

Arnold Kriegstein和Michael Oldham领导研究团队比较了小鼠和人类的放射状胶质细胞（radial glial cell）。他们发现，在大脑皮层的发育过程中，这些细胞里激活的基因大部分相同。不过有18个基因只在人类放射状胶质细胞中有活性，PDGFD就是其中之一。

血小板来源的生长因子(PDGF)家族包括4个多肽，它们组装成5个二聚体异构体(PDGF- aa、PDGF- bb、PDGF- ab、PDGF- cc和PDGF- dd)，并与两种受体酪氨酸激酶(PDGFR fr和PDGFR fr)结合，这两种受体主要表达于间充质来源的细胞上。

03 主要方法

主要实验

• NCR2转基因小鼠的制备
• 筛选GNF分泌库
• 抗体、蛋白质和肽的固定化
• 固相结合试验
• 使用flexstation III进行钙成像
• 免疫印迹法
• 稳定细胞系的产生
• 表面等离子体共振
• 肿瘤生长抑制试验
• ILC子集的排序
• 癌细胞表面NK细胞受体配体的检测
• HIV gp41肽对人CD4+ T细胞的刺激作用
• 细胞因子分泌分析
• 组织免疫染色
• 测量肺肿瘤面积
• 实时荧光定量PCR

数据

• 4个正常人的NK细胞以及一个AF1的3种处理(250 ng/mL PDGF-DD or PMA/ionomycin or left unstimulated)的数据，共15个样本，数据都在GSE107047
• 使用PDGF-DD刺激与否的人类扁桃体ILC1细胞表达水平的变化：GSE107043
• Colo38，Meljuso (both melanoma)，OVCA (ovarian) and MCF7 (breast) 4种癌症细胞系的3种处理(negative_supernatant，NKDD_supernatant，media)数据， 共12个样本，数据都在GSE107047
• 公共数据：
  • TCGA GBM mRNA gene expression data (n = 539 patients) was downloaded through the UCSC data portal (https://xenabrowser.net) and matched to the gene expression data.

04 结果

PDGF-DD Is a Ligand for NKp44

1. unbiased screen of a secretome protein library 无偏差筛选分泌蛋白库

作者对包含4000个纯化的人和老鼠分泌蛋白或NKp44配体的单次跨膜蛋白外域的分泌体蛋白文库进行了无偏选筛选。

1. 通过流式细胞仪检测GFP表达情况，筛选到前30个分泌蛋白，其中PDGF-D被确认为NKp44配体(图1B;表S1)。
2. PDGF-D是PDGF家族的一员。PDGFD、PDGF-D和PDGF-DD亚型示意图:信号肽(SP，白色);幼崽域(蓝色);生长因子区域(GFD，红色);黑色三角形，蛋白酶裂解位点;黑线，二硫键。

图D-F通过 solid phase binding assay证明了NKp44能与PDGF-DD相结合，并具有特异性(图1F)。

PDGF-DD诱导的NKp44-GFP报告细胞的激活呈剂量依赖性，且在高PDGF-DD浓度下达到饱和状态(图1G)。Biacore分析确定PDGF-DD对NKp44的Ig超家族（IgSF）结构域具有3.3±0.4μM的亲和力（图1H），处于PDGF / PDGFR相互作用的已知范围内，并得到证实 NKp44不会与未经处理的PDGF-D结合（图1I）。

这些结果表明，经蛋白水解处理的“活性” PDGF-DD生长因子是NKp44的真正配体：

PDGF-DD Triggers NK Cell Activation and Cytokine Secretion via NKp44

PDGF-DD与NKp44的结合会触发人类NK细胞中的ITAM信号传导：

作者探索了PDGF-DD-NKp44相互作用对NK细胞功能的影响：

• 随着浓度增加的PDGF-DD诱导的CD107a剂量依赖性细胞表面表达的增加，正常供体的IL-2活化的NKp44+ NK细胞被孵育（图S2B），这表明细胞因子的分泌和/或裂解颗粒的释放。

• PDGF-DD通过NKp44而不是通过其他受体起作用。NKp44仅与其他激活受体结合才能促进靶细胞裂解。

图C-F再次证明特定的PDGF-DD/NKp44相互作用。

DAP12缺陷的NK细胞在细胞表面缺乏NKp44和所有DAP12相关受体的表达。细胞内对IFN-γ和TNF-α的染色显示，PDGF-DD刺激正常NK细胞，诱导产生IFN-γ的细胞以及分泌IFN-γ和TNF-α的双功能细胞(图2G)。细胞表面染色显示PDGF-DD刺激NK细胞NKp44的细胞NKp44下调(图2H)，可能反映了配体诱导的该受体的内化。

作者通过设计蛋白酶裂解位点CUB-TEV-PDGFD进一步证明活性PDGF-DD可诱导NK细胞细胞因子的分泌。(图S2D-S2F)

作者通过RNA测序(RNA-seq)及PDGF-DD诱导的转录变化的独创性通路分析(IPA)，得出PDGF-DD结合和通过NKp44/DAP12受体复合物的信号转导导致明显的NK细胞活化，其特征在于促炎性细胞因子和趋化因子的分泌。

• 转录组数据包括4个正常人的NK细胞以及一个AF1的3种处理（ 250 ng/mL PDGF-DD or PMA/ionomycin or left unstimulated ）的数据，共15个样本，数据都在GSE107047
• 这4个正常人的NK细胞的PDGF-DD 处理与否转录组数据比较后做了火山图和热图，还有KEGG富集分析，说明PDGF-DD 的处理主要改变的是免疫相关的通路。

PDGF-DD Triggers Cytokine Secretion in ILC3 and ILC1

ILC3和ILC1与肿瘤免疫监测相关。用特异性单克隆抗体mAb作为替代配体刺激ILC3中的NKp44可选择性诱导TNF-α。PDGF-DD在ILC3，转化的ILC3和上皮内ILC1中诱导NKp44依赖性促炎基因程序。

• 使用PDGF-DD刺激与否的人类扁桃体ILC1细胞表达水平的变化：GSE107043 使用的是 Affymetrix Human Gene 1.0 ST 芯片。
• In comparison to un-stimulated ILC1, PDGF-DD induced the expression of 127 genes and downregulation of 102 genes，发现PDGF-DD 作用于人类扁桃体ILC1细胞的效果与作用于NK细胞的效果类似。

PDGF-DD-Activated NK Cells Induce Tumor Cell Growth Arrest

含有细胞因子的NK(DD+IgG) sup 可以诱导一种短暂的肿瘤细胞生长抑制。

NK(DD+lgG) sup 处理的肿瘤细胞仍然具有代谢活性。它们分泌更多的IL-8(图4E和4F)和IL-6(图4G)，这可能会诱导炎症细胞的募集。

经NK(DD+lgG) sup处理的肿瘤细胞上调了CADM1、CD112和CD155，可激活或抑制NK细胞介导的裂解(图4H)。此外，肿瘤细胞在遇到表达CD95L (FasL)的NK细胞时，会上调CD95 (Fas)(图4H)，导致细胞凋亡。

检验PDGF-DD 作用于肿瘤细胞系

• 这里使用了 Colo38 and Meljuso (both melanoma), OVCA (ovarian) and MCF7 (breast)这4种癌症细胞系的3种处理（negative_supernatant，NKDD_supernatant，media）数据， 共12个样本，数据都在GSE107047
• 这4个癌症细胞系转录组数据也是比较了两种处理，做了火山图和热图，还有KEGG富集分析。

作者通过RNA-seq检测了NK(DD+IgG) sup或NK(DD+NKp44) sup处理的肿瘤细胞株的整体基因表达。NK(DD+IgG) sup诱导了大量独特转录本的表达(738)，其中许多转录本反映了IFN-γ和TNF-α的影响(图4I)。与未受刺激的细胞(1192)相比，下调的转录本包括许多细胞周期基因(图4I)。

IPA分析证实，使用PDGF-DD活化的NK细胞的TC上清液处理癌细胞可以诱导包括IFN-γ 信号通路、抗原递呈和细胞周期控制染色体复制的途径(图S4)。

总之，这些数据表明，暴露于PDGF-DD诱导的NK细胞分泌细胞因子的肿瘤细胞会经历细胞周期阻滞，但也会表达炎性细胞因子、趋化因子和细胞表面配体，这些配体可广泛影响对肿瘤的免疫反应。

Expression of NKp44 Correlates with Distinct Cytokine and Cell-Cycle Gene Expression Signatures in GBM

PDGF-D在GBM中表达(图5A)，且与血管增生高度相关(图5B)。PDGF-D在许多具有侵袭性特征的人类肿瘤的癌细胞和/或基质中表达。

细胞因子相关基因和细胞周期相关基因在所有转录组样本的表达情况。

TCGA数据集

在TCGA的GBM的芯片表达数据里面可以看到 以下正相关关系：

• NCR2 expression
• upregulation of PDGF-DD-induced NK cell cytokine genes (芯片数据)
• downregulation of tumor cell-cycle genes
• greater survival

TCGA GBM mRNA gene expression data obtained using the Affymetrix HT Human Genome U133a microarray platform (n = 539 patients) was downloaded through the UCSC data portal (https://xenabrowser.net) and matched to the gene expression data (Figures 4C and 4D). 7 of 9 cytokine genes (Figure 4C) and 27 of 34 cell cycle genes (Figure 4D) were matched with the GBM cohort.

分别如下图：

PDGF-DD Binding toNKp44 Limits Tumor Growth In Vivo

由于NKp44仅在人类中编码，作者开发了细菌人工染色体（BAC）NCR2转基因（tg）小鼠，以确定PDGF-DD/NKp44相互作用对体内癌症的影响。

在稳定状态下，在脾脏和淋巴结NK细胞中发现了一小部分NKp44(图6A、S6A和S6B)。NKp44还表达在小肠中较大的ILC3子集和少量NK/ILC1细胞上（图S6C和S6D）。

在体外被IL-2和IL-15激活后，NK细胞NKp44明显上调，炎症细胞因子进一步刺激NKp44升高(图6B)。

作者选择B16转移性肿瘤模型(对NK细胞IFN-γ分泌能力敏感)。NCR2-tg小鼠中B16-PDGFD细胞的高排异反应依赖于NKp44。NCR2-tg小鼠在限制B16F10细胞方面不具有非tg小鼠固有的优势。

PDGF-DD/NKp44相互作用促进NK细胞控制体内肿瘤的扩展。

NKp44-PDGF-DD Interaction Enhances Checkpoint Blockade

1. 首先在NCR2-tg小鼠的肺部和淋巴结中检测了NK细胞NKp44以及抑止检查点受体PD-1、TIGIT和CD96 的表达。
2. 此外，IFN-γ 和TNF-α 小鼠模型诱导了CD96配体、CD155作用于B16F10细胞。

• 阻断CD96-CD155的相互作用可能会增强NK细胞的活化，限制B16-PDGFD细胞的转移。
• PDGF-DD/NKp44相互作用和抗CD96免疫疗法在B16-PDGFD细胞转移的NK细胞控制中协同作用。

NKp44 Engagement Boosts CpG-Induced Control of Subcutaneous Melanoma

研究表明CpG-ODN免疫治疗可以刺激皮下B16黑素瘤NK细胞的招募、激活和NK细胞依赖的消退。

• 当浸润NK细胞被肿瘤表达的PDGF-DD激活时，CpG-ODN可以更有效地抑制实体瘤的生长。

延伸

1. SPR表面等离子共振法+Biacore分析

(1)SPR: Surface plasmon resonance，表面等离子体共振，本质上是一种物理光学现象。

(2)SPR使用范围：

• DNA-DNA间生物特异性相互作用
• 蛋白质折叠机制的研究
• 微生物细胞检测
• 抗原-抗体分子亲和力测定

(3)Biacore：

BIACORE 表面等离子共振仪基于 SPR 原理的新型生物传感分析技术，它在不需使用荧光或同位素标记甚至无须纯 化各种生物组分的天然条件下，通过传感器芯片实时监测各类生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂 甚至全病毒、细胞之间相互作用的整个过程，并通过分析软件获取生物分子结合、解离、亲和性、特异性、协同、 拮抗、反应速率、浓度变化等互作动力学参数。

2.SPR与ELISA相比：

3. Ingenuity pathway analysis (IPA)

Pathway analysis of RNA-seq data was performed using IPA software (QIAGEN)

官方链接：https://www.qiagen.com/us/

IPA能够分析、整合基因表达，microRNA，SNP微阵列的数据，代谢物组学和蛋白质组学的实验数据，和一些可产生基因、化学品列表的小规模实验的数据。IPA分析组学数据主要有经典通路、上游转录调控、下游调控子效应、疾病与功能以及network等多个结果。