BIB |免费通用且详尽的计算抗体设计方案——IsAb

作者|王玉杰 审稿|杨慧丹

本文介绍比兹堡大学药学院的Tianjian Liang等人在Briefings in Bioinformatic发表的文章“IsAb: a computational protocol for antibody design”，作者提出了治疗性抗体的in silico设计方案——IsAb，其结合了多种抗体工程技术，为计算抗体设计提供了通用且明确的指导，还提供了解决抗体设计中一些挑战的解决方案。为了验证IsAb，作者重新设计了D44.1抗体，并与之前的报道数据进行了比较，作者还以设计cemiplimab抗体为例展示了详细的工作流程，为未来的计算抗体设计带来了启示。

背景

抗体被广泛用于癌症、自身免疫性疾病等的免疫治疗，其在对抗如COVID-19等传染性病毒也发挥重要作用，具有巨大的治疗潜力，市场也在逐步扩大，因此抗体设计的发展必不可少。抗体再设计是抗体设计的重要方法之一，具有更容易修改抗体的特性，能更快地应用于临床的特点。抗体再设计的传统实验方法耗时耗力，计算方法成为辅助抗体设计的替代策略，但仍存在一些挑战，如抗体-抗原复合物的结合信息可能有限、某些抗原在与抗体相互作用时可能发生显著的构象变化，且大多数抗体设计工作都需要用户付费。

IsAb介绍

简述IsAb工作流程

如图1，首先获取抗体和抗原的结构，可以从IMGT（http://www.imgt.org/）中检索抗体序列，再从Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）下载。步骤2，使用RosettaAntibody（https://rosie.graylab.jhu.edu/）进行建模，将序列转换成relaxed structure。步骤3，应用RosettaRelax方案完善其结构，尽可能还原至原始状态。步骤4，进行抗原抗体对接，若结合信息可用则可跳至步骤5，若结构信息有限，则将结构提交给ClusPro进行全局对接，生成抗体-抗原复合物几种可能的结合态。步骤5，根据全局对接结果，由SnugDock进行局部精修，实现界面侧链和CDR环的连接，输出最终的抗体-抗原复合物。步骤6，根据提炼出的抗体-抗原复合物，进行丙氨酸扫描：(i)先将残基突变为丙氨酸，(ii)计算突变过程中残基的能量变化，找出抗体上的关键残基。步骤7，基于Rosetta评分功能，应用抗体亲和力成熟策略生成最佳突变抗体，该抗体具有比原始抗体更好的亲和力和稳定性。

图1 IsAb抗体设计方案工作流程

数据准备及具体方法

(1)结构生成与准备

从Protein Data Bank（https://www.rcsb.org/）下载抗原或抗体的3D结构。对于抗原，用PyMol从抗原-抗体复合物中提取其3D结构。抗体Fv序列从IMGT(http://www.imgt.org/)获取，提交至ROSIE(https://rosie.graylab.jhu.edu/)使用RosettaAntibody进行3D结构的建模，建模结果选用web server提供的'Grafted-Relaxed-Model。对抗原应用RosettaRelax方案，最后在10个输出结果中选择得分最低的结果作为relaxed structure。

(2)抗体-抗原全局对接

选择ClusPro（https://cluspro.bu.edu/login.php）的'Antibody Mode'执行抗体-抗原的全局对接，其中在"Attraction and Repulsion"部分，将从Robin等人开发的数据库中预测的可能互补位输入到"attraction"框中，以提高对接的准确性。

(3)抗体-抗原局部对接

使用ROSIE的SnugDock功能(https://rosie.graylab.jhu.edu/snug_dock)对全局对接产生的抗原-抗体结合态进行完善，然后选择“thorough mode”执行本地对接，并根据是否形成了对接漏斗来决定是否接受对接结果。对接完成后选择最低I_sc结果。使用EMBL“Clustal Omega”（https://www.ebi.ac.uk/services）将抗体序列与其他抗体进行比较，以发现抗体-抗原复合物的可能结合位姿。

(4)丙氨酸扫描和抗体的亲和力成熟

使用Rosetta进行丙氨酸扫描（AlaScan.xml，https://github.com/Kortemme-Lab/ddg/）预测抗体上可能的关键残基，亲和力成熟基于Jens Meiler博士的网站（http://www.meilerlab.org/index.php/rosetta-tutorials）生成，接下来应用Rosetta的通用脚本分析结果，最后计算突变过程中残基能量的变化并绘制能量变化图。

(5) MD仿真和MM/GBSA计算

使用AMBER18软件包在有cemiplimab突变的4个cemiplimab-PD-1系统（H：G100A，N101G，I102T和Y103A）上进行MD仿真，并在NPT MD方针的采样阶段均匀选择100个快照用于MM/GBSA结合自由能分解分析，计算各残基与其配体的相互作用能，并使用MM/GBSA模型考虑溶剂效应。

案例验证

重新设计抗体D44.1

首先，从IMGT数据库中得到D44.1序列（序列号：1mlc），使用RosettaAntibody获得其3D结构，从Protein Data Bank（PDB: 1mlc）得到溶菌酶结构，通过RosettaRelax将溶菌酶结构最小化。然后，将D44.1和溶菌酶结构提交给ClusPro，选择了溶菌酶的41-51和66-71残基作为表位。通过与其他溶菌酶抗体的序列比较，选择与HyHEL-5-lysozyme复合物相似的位态。然后应用SnugDock来完善全局对接，在局部对接结果中形成了对接漏斗，表明对接的成功。最终挑选最低I_sc结果作为D44.1-lysozyme复合物的最终对接位姿。

基于得到的D44.1-lysozyme结构，应用Rosetta亲和力成熟策略设计D44.1，将结果与Lippow等人的工作进行比较，其中IsAb关注的是界面残基，而不是位于界面上的所有CDR残基。图2A中，大多数设计模型的分值都很接近，而且设计组的平均分值低于对照组，说明设计组的结构可能比对照组更具有能量优势。据图2B，设计组的平均结合密度值比对照组低，说明设计的复合物可能比对照组有更好的结合亲和力。图2C中，对照组的平均结合能高于设计组，表明设计组有更好的稳定性。

图2 抗体D44.1对照组和设计组三个指标的箱形比较图。

设计Cemiplimab

作者以cemiplimab为例，全面详细地展示了在抗体没有结构或没有结合信息的极端情况下的设计步骤。Cemiplimab是一种经过FDA批准的PD-1检查点抑制剂，用于治疗皮肤鳞状细胞癌（cSCC），其相关文献大部分集中在临床数据上，意味着Cemiplimab和PD-1的相互作用信息有限，且目前没有Cemiplimab三维晶体或冷冻电镜结构的报道，且在不同条件下解析的PD-1的结构也不同。由于缺乏cemiplimab-PD-1复合物的结合信息，作者采用两步对接来预测复合物可能的结合姿势。最后根据预测和MD模拟仿真，所设计的Cemiplimab理论上比原来的抗体有更好的亲和力和稳定性。

图8 四种突变与对照组Cemiplimab的MD仿真结果比较。G100A（紫色）/N101G（青色）/I102T（橙色）/Y103A（绿色）和对照组（粉色）之间的结合亲和力（G）及其能量项的比较。

总结

区别于以往的方法， IsAb主要是对抗体进行重新设计，优化抗体序列，其首先使用RosettaAntibody对抗体的3D结构进行建模，在缺乏结合信息的情况下，使用全局对接产生可能的结合态，随后使用SnugDock完善抗体-抗原复合物并产生最终的结合态。此外，使用丙氨酸扫描预测抗体上的关键残基，最后计算亲和力成熟度以提高抗体的亲和力和稳定性。作者通过设计抗体D44.1和cemiplimab验证了IsAb的可靠性，IsAb为抗体设计过程中的常见问题提供了解决方案，并提供了全面的抗体设计教程，其他领域的用户可以轻松上手免费使用。

参考资料

Tianjian Liang, Hui Chen, Jiayi Yuan, Chen Jiang, Yixuan Hao, Yuanqiang Wang, Zhiwei Feng, Xiang-Qun Xie, IsAb: a computational protocol for antibody design, Briefings in Bioinformatics, 2021;, bbab143,

https://doi.org/10.1093/bib/bbab143

示例数据

https://github.com/stcmz/isab-bib-examples