宏基因组功能注释（以COG为例）

生信菜鸟团

发布于 2021-04-29 11:38:26

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Contigs/Scaffolds序列经基因预测、ORF开放阅读框识别（Open Reading fr ame）和蛋白翻译之后，就可以进行功能注释分析了。我们将基因/蛋白序列在特定的数据库中搜索比对，从而完成功能注释分析。常用的功能数据库主要包括KEGG、EggNOG、GO、COG和CAZy等。

功能注释就是我们拿到翻译的蛋白之后，与不同的功能（蛋白）数据库进行对比。至于选择哪种数据库要看研究者的目的以及数据条件（如真核还是原核）。我们选择COG数据库，原因是目前单位还没有相应的流程，在一步步的操作中有助于我们的理解。

COG是干嘛的

COG，即Clusters of Orthologous Groups of proteins。可以理解为COG是NCBI的数据库。COG的中文释义即“同源蛋白簇”。COG分为两类，一类是原核生物的，另

COG注释作用：1. 通过已知蛋白对未知序列进行功能注释；2. 通过查看指定的COG编号对应的protein数目，存在及缺失，从而能推导特定的代谢途径是否存在；3. 每个COG编号是一类蛋白，将query序列和比对上的COG编号的proteins进行多序列比对，能确定保守位点，分析其进化关系。当然，这里我们说的是第一种作用。

NCBI COG的数据库主要更新历史

从 1997 年第一个公布版本,7个完整基因组，720个COG分类，包含原核基因组和单细胞真核基因组（酵母），2003 年和2014 年进行了版本升级，最后只保留了细菌和古菌，包含了711个基因组以及4,631个COG分类， 26个功能分类。 2013 年构建真核分支COG（KOG, Eukaryotic orthologous groups）； 2007 年构建古菌分支COG（arCOG， Archaeal Clusters of Orthologous Genes），2012 年和2014 年arCOG进一步升级，arCOG比较适合用于古菌基因组注释； 2011 年构建Phage分支COG（POG，phage orthologous groups），2013 年进行了升级；

由于计算资源需求，NCBI COG 构建了不同系统分类分支的COG簇，比如arCOG，KOG, POG等，推荐使用这些分支对新测序基因组进行注释，其实eggNOG 尤其是4.x版本也使用了clade特异的聚类模式。

其实，eggNOG(版本 4.5.1+) 数据库对 NCBI COG 进行扩展，并包含了真核生物信息，版本 3.0 被广泛应用于（元）基因组数据分析，另外一个类似数据是 STRING （版本 10.0）也可以实现COG/KOG的功能注释，主要特色是蛋白质相互作用注释，eggNOG 升级到了 4.0 以后提供基于HMM隐马尔可夫谱的分析，并提供了更细致的 OG 分析，可根据物种所属的clade选择参考数据集，可以有效的降低计算量，另一个特色就是提供了 GO以及其它注释信息（KEGG/COG/SMART）关联分析。

从2003年至2014年NCBI COG一直未更新，EMBL EggNOG(evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups)继承了NCBI COG的衣钵，极大的扩展了基因组信息。5.0 版本，把包含了 5090 个基因组，其中 2502 病毒基因组， 4.4M 个直系同源家族。如果做了eggNOG功能注释还有必要做COG注释吗？

eggNOG 数据库包含了丰富的注释信息，除了COG/KOG/NOG的分类和注释信息外，还包含了KEGG/GO/SMART/PFAM信息。

新版本的EggNOG 还提供了自动化注释工具eggnog-mapper，可很方便的完成基因组的功能注释，注释信息可以关联COG/KOG/KEGG/GO/BiGG等。

怎样注释的

既然EggNOG数据库比COG数据库更新更全面，那我们还讲COG干嘛？要知道，COG老是老了一点，那是人家经典。而且目前两者都可以用同一种比对软件来注释，所以不影响阅读。序列决定结构，结构决定功能。功能注释本质是目标蛋白序列同功能蛋白序列数据库的比对过程。

宏基因组数据比对神器 DIAMOND（double index alignment of next-generation sequencing data)）

2015年nature methods上发布了一款新的比对软件DIAMOND，是一款新的用于短DNA测序reads与蛋白参考数据库比对的工具。以Illumina的100~150 bp的reads为例，在快速模式下，DIAMOND比对速度比BLASTX要快20,000倍，可以报告BLASTX发现的80-90%的比对数据，e-value至多为1e-5。如果使用灵敏模式，DIAMOND的比对速度也要比BLASTX快2,500倍，可以报告超过94%的比对数据。

1）使用DIAMOND软件将 Unigenes 与各功能数据库进行比对（blastp，evalue ≤ 1e-5） 2）比对结果过滤：对于每一条序列的比对结果，选取 score 最高的比对结果（one HSP > 60 bits）进行后续分析

Function/DIAMOND/diamond blastp -q Unigenes_50.fa -d database/COG/cog_clean.fa -t COG/blastout -p 4 -e 1e-5 -k 50 --sensitive -o Unigenes_50.fa.m8

double indexing
spaced seeds

比对结果，m8格式12列对应的含义依次是：

  Query id：查询序列ID标识
  Subject id：比对上的目标序列ID标识
  % identity：序列比对的一致性百分比
  alignment length：符合比对的比对区域的长度
  mismatches：比对区域的错配数
  gap openings：比对区域的gap数目
  q. start：比对区域在查询序列(Query id)上的起始位点
  q. end：比对区域在查询序列(Query id)上的终止位点
  s. start：比对区域在目标序列(Subject id)上的起始位点
  s. end：比对区域在目标序列(Subject id)上的终止位点
  e-value：比对结果的期望值，解释是大概多少次随机比对才能出现一次这个score,Evalue越小，表明这种情况，从概率上越不可能发生，但是现在发生了，所以这个比对具有很重要的意义
  bit score：比对结果的bit score值

功能层级：

INFORMATION STORAGE AND PROCESSING
 [J] Translation, ribosomal structure and biogenesis 
 [A] RNA processing and modification 
 [K] Transcription 
 [L] Replication, recombination and repair 
 [B] Chromatin structure and dynamics 

CELLULAR PROCESSES AND SIGNALING
 [D] Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning 
 [Y] Nuclear structure 
 [V] Defense mechanisms 
 [T] Signal transduction mechanisms 
 [M] Cell wall/membrane/envelope biogenesis 
 [N] Cell motility 
 [Z] Cytoskeleton 
 [W] Extracellular structures 
 [U] Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport 
 [O] Posttranslational modification, protein turnover, chaperones 
 [X] Mobilome: prophages, transposons

METABOLISM
 [C] Energy production and conversion 
 [G] Carbohydrate transport and metabolism 
 [E] Amino acid transport and metabolism 
 [F] Nucleotide transport and metabolism 
 [H] Coenzyme transport and metabolism 
 [I] Lipid transport and metabolism 
 [P] Inorganic ion transport and metabolism 
 [Q] Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism 

POORLY CHARACTERIZED
 [R] General function prediction only 
 [S] Function unknown