文章复现-靶向NDM-1的大环肽抑制剂的计算设计

前言

这文章大约，已经拖了一个月了，不出意外，我还会拖很久

本来呢，看了一眼正文，9页，也还好。预期是打算写一个爽文，震惊复现PNAS，你上你也行系列。

然后，下载了一下支持材料

有些文章，正文只能算一个Abstract。

不过，挺好的，值得仔细研读。

而且，我这个公众号，一向不是为了讨好读者，迎合社会而设计的。

那么，接着研读吧。

先看摘要

作者提出了一种基于结构的计算方法，设计由L-和D-氨基酸构建而成的大环肽，用于新型抗生素药物研发，这些大环肽可以与NDM-1(New Delhi metallo-β-lactamase 1)结合，并抑制其活性。

作者的方法考虑到了肽倾向于结合构象，此方法可以预测7种被设计出的多肽的活性实验中的rank。

作者确定了三种与NDM-1复合的抑制剂的X射线晶体结构，并且在三种抑制剂中，肽的构象都非常接近计算的模型。

在上述三种复合物中的两种结构中，多肽与NDM-1的结合模式也与设计模式非常相似。而在第三种结构中，作者观察到了一种替代的结合模式，这种结合模式可能是由设计中的形状的内部对称性与靶点的灵活性的结合引起的（internal symmetry in the shape of the design combined with flexibility of the target）。

什么叫，设计中的形状的内部对称性--internal symmetry in the shape of the design

尽管在某些方面仍然存在缺陷，例如：预测靶点骨架变化，结合模式，以及突变对结合亲和力的影响，但是作者设计的有序的，有结合能力的大环化合物对广泛的治疗靶点具有广泛的适用性。

关键词

antibiotic resistance | drug design | protein folding | peptide macrocycles | computational design

简介

尽管我们已经有了疫苗以及抗生素，但是新发的病原体仍然是公众健康的主要威胁。特别是随着细菌的耐药性的上升，也威胁着抗菌药物的临床应用，如：β-内酰胺类抗生素（β-lactam）。耐药性阻碍了脓毒症的临床治疗，脓毒症是目前造成医院死亡病例的最常见原因，也是目前治疗细菌感染的主要关注点。耐药性的机制多种多样，目前许多耐药性的病原体都可以降解β-内酰胺类抗生素。The New Delhi metallo-β-lactamase 1（NDM-1）于2008年在瑞典被发现，之后不久又在世界许多其他国家被发现。这种酶甚至可以降解如碳青霉烯类（carbapenems，这是β-lactams 最后的手段）。目前，我们所处的时代是一个在化学上极为多样性的β-内酰胺类抗生素也可以容易被病原体所降解，所以开发新的、耐降解的抗生素的前景越来越渺茫。这同样产生了另外一种策略：当抑制剂与现存的 β-lactam抗生素组合使用时，此抑制剂可以减轻细菌对 β-lactam类抗生素的抵抗能力。然而，目前还没有临床上批准的药物能够抑制NDM-1或任何其他金属离子-β-内酰胺酶。

药物与靶标的高亲和力的结合依赖于在结合态和非结合态之间有一个大的自由能隙：药物与靶标之间结合的焓有利性必须大于结合的所付出的熵代价。设计方法通常侧重于最大化分子和靶蛋白之间的有利相互作用，以最大化亲和力和特异性。不幸的是，当在增加化学基团以增加药物与靶标之间的相互作用时，设计出的药物也变得更加灵活。这就产生了与分子有序化相关的熵成本，使其能够结合，这降低了亲和力，也引入了药物可能采样替代构象结合的可能性，这降低了特异性。一个理想的设计方法将最大限度地提高药物与其靶分子间相互作用，同时最大限度地提高药物在未结合状态下的刚性，因为这两个因素对结合都是至关重要的。

作者之前报道了在Rosetta软件中实现的计算方法，用于设计和验证由天然和非天然氨基酸一起构建的刚性环肽。刚性结构的大环肽在结合时其构象倾向性变化较小，作者的工作假设是这可以解决阻碍柔性中尺度分子的问题，并实现更高的亲和力结合。大环肽还结合了大分子（蛋白质）疗法和小分子药物的中许多优良的特性。与蛋白质疗法一样，大环肽具有大的表面积，有利于于高亲和力、特异性的靶标识别。中尺度和大分子疗法的共同特性可以解释它们在达到临床试验阶段时观察到的较高的成功率。同时，D-氨基酸的引入降低了免疫系统的识别率和对蛋白酶的敏感性，这两个因素都限制了细胞中针对于药物的蛋白质作用。类似于小分子，大环肽的摩尔量更大，易于储存，并且相对容易管理。一些天然大环肽，如环孢霉素A，其口服生物利用度和细胞通透性堪比小分子药物。

从NDM-1与L-卡托普利结合的X射线晶体结构开始，作者调整了大环肽的设计方法，以创建NDM-1抑制剂，在优化与靶点的相互作用的同时和提高了结合活性构象的刚性。为了达到提高结合活性构象的刚性的目的，作者在构象中设计了有利的内部相互作用，并策略性地结合刚性构建块来降低替代构象的偏好。通过酶抑制实验和晶体学研究，设计抑制NDM-1的效力比D-卡托普利对照组高50倍，同时以设计的结合模式结合到活性部位，并采用设计的结合构象。

与涉及大量化合物库的传统药物筛选方法不同，作者的方法使得高通量探索转移到管道阶段的虚拟筛选，并从只有7个肽的初始实验筛选中找到hits。这里开发的计算方法代表了一种设计刚性结构的大环肽的通用框架，适用于NDM-1以外的许多靶点。

重点

大环肽类一类很有前途的药物，但它们的缺点是构象的灵活性：与靶标的亲和力会被环肽从无序非结合态到有序结合态的不利转变所限制。靶亲和力会受到从无序非结合态到有序结合态的不利转变的限制。作者介绍了一种通用的计算方法可以稳定大环肽的一部分结合构象(此部分被设计用于结合到目标蛋白)。实验证明，作者所设计出的 New Delhi metallo-β-lactamase 1 ，新的抑制剂。此抑制剂的肽的刚性构象的预测值与实验结果相关，设计优于合成和测试。这些方法有助于设计不同治疗靶点的肽大环抑制剂。

结果与讨论

注，偏向于计算过程，对于实验部分，并不会很详细

基于结构进行设计的理性方法

NDM-1被卡托普利的L型和D型异构体竞争性抑制。据报道，D-异构体要比L-异构体强25倍，但只有L-异构体具有可用的X射线晶体结构（PDB ID 4EXS），作者在肽设计工作起始时将其用作起点结构。卡托普利堵塞了NDM-1活性位点口袋。与口袋相邻的是210位到228位氨基酸所组成的有序环（front loop ，FL）和由64位至73位氨基酸组成的柔性铰链环（ hinge loop ，HL）。HL的存在显示了相当大的构象异质性，在不同的结构，甚至是在单晶结构的不对称单元中分子的拷贝中（Fig.1B）。HL的灵活性对抑制剂的研发来说是一个很大的挑战。作者假设了晶体中观察到的HL构象或许呈现出此loop所处的低能状态。因为在4EXS 中B链中，Phe70更倾向于和抑制剂形成良好的疏水作用，因此我们使用此构象作为虚拟设计工作。

L-卡托普利类似于D-半胱氨酸-L-脯氨酸二肽(但是其甲基被胺所取代)。当它与NDM-1活性位点结合时，硫原子插在两个催化作用的锌原子之间并与之结合，脯氨酸填充活性位点口袋的空间（Fig. 1C)）。虚拟设计中，作者将4EXS结构中的L-卡托普利中的甲基转化为胺，产生D-半胱氨酸-L-脯氨酸二肽--“Stub”，结合在NDM-1活性部位附近。然后，作者扩展了这个Stub，通过酰胺键将一个三聚甘氨酸链连接到D-胱氨酸上，并且将一个三聚甘氨酸链附加到L-脯氨酸的C末端以产生一个八残基的肽（Fig. 1D)。使用Rosetta generalized kinematic closure，作者对该链的构象进行了采样（这些构象产生一个酰胺键来链接其两个末端），并且具有良好的分子内部主链氢键，从而保持D-半胱氨酸-L-脯氨酸起始端固定。

对于每一个取样的构象，作者对其序列进行了设计以最大化其与靶标的有利相互作用，设计出的有利构象，使用Rosetta side-chain packing （对L-和D-氨基酸进行采样）（Figure 1.E）。这是基于蒙特卡罗的refinement程序实现的，在该程序中，作者使用generalized kinematic closure对肽构象进行小扰动构象采样，重新优化侧链以及对其rotamers进行采样。作者根据其内部氢键的数目，与靶标的形状互补性，以及原子碰撞来对初始设计进行过滤。为了评估其骨架多样性，作者分了4个类：A（left- handed α-helical）、B（left-handed β-strand）、X（right-handed α-helical）和Y（right-handed β-strand）附录第2.1.6节对此进行了更详细的描述，并将每个氨基酸都进行了分类。作者选择了具有多样性的骨架bins string，同时因为作者假设刚性是影响成功的重要因素，因此作者使用Rosetta simple_cycpep_predict protocol来确定在没有靶标的情况下，可能折叠到结合活性构象的设计。作者使用了前面描述的PNear来进行衡量，它近似于设计构象的分数占有率（Boltzmann权重），在大范围构象取样产生的一组替代构象中。接近0的PNear值表明倾向于结合活性构象的预测很少，而接近1的值表明倾向于结合活性构象的预测很高（附录，第1.5.4节）。

附录

第1.5.4节Ensemble analysis during peptide conformational sampling

多肽构象采样过程中的集合分析

度量Pnear, 如前所述，表示在靠近所需构象的构象空间区域中发现所需构象的估计概率，其中该区域用软边界定义（在重复模拟中所实现数值稳定性。在一个大的构象空间中采样了N个模拟样本,并报告了能量Ei和其与理想构象ri的RMSD值, 对于第i个样本。Pnear公式如下：

第2.1.6节 Backbone conformational bin analysis

骨架构象的bins分析

作为在进行选择时进行的最后考虑，作者在设计中寻求其骨架构造的多样性，特别是对于NDM1i-1设计。为了对骨架构象进行分类，作者使用前面描述的A，B，X，Y命名法为每个残基分配了一个骨架构象bins。简言之，残基与主干φ 大于0的二面角被分配给X或Y，那些φ 角度小于0° 被分配到A或B。箱A含有ψ 角度在-125° 和50°之间, B箱中含有ψ 角度超出此范围。类似地，箱子X含有ψ 角度在-50° 和125°之间, 垃圾箱Y含有ψ 角度超出此范围。在NDM1i-1设计中，选择的七个肽代表四个独特的箱子串。