【生信文献200篇】34 SIRT6敲除的食蟹猴模型

00 文章信息

英文标题： SIRT6 deficiency results in developmental retardation in cynomolgus monkeys

中文标题： SIRT6缺乏导致食蟹猴发育迟缓

期刊：《Nature》

影响因子: 42.778 发表时间: 2018 Aug

研究领域：基因敲除

DOI号：10.1038/s41586-018-0437-z

01 文献概述

物种：cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) 如下：

看起来就是他们团队使用CRISPR-Cas9技术创造了一个雄性猴子胚胎和三个雌性猴子胚胎，它们均不表达SIRT6。结果发现，雌性猴子在出生后不久就死亡了，而雄性胚胎在怀孕中期死亡。然后就使用转录组测序手段探索了基因编辑的猴子的表达变化情况。

02 实验数据

1.数据

总共测序得到241.16 G数据，表达矩阵在 GSE102830, WGS 验证crispr的原始测序数据在 SRP149748

值得注意的是作者同时把数据上传到了北京基因组所： (http://gsa.big.ac.cn/) under accession number PRJCA000909.

参考基因组用的是： M. fascicularis reference genome (macFas5)

作者公布的表达矩阵是以FPKM作为归一化手段，可能需要重新处理该数据，如果想走自己的下游分析。

涉及到7个器官，总共是6只 食蟹猴,分别是：

organs    brain heart kidney liver lung muscle thymus
  KO2     2     2      2     2    2      2      2
  KO3     2     2      2     2    2      2      2
  T2M     2     0      0     0    0      2      0
  T4M     2     0      0     0    0      2      0
  WT2     2     2      2     2    2      2      2
  WT3     2     2      2     2    2      2      2

03 实验结果

1. SIRT6−/−猴子

构建缺失SIRT6的食蟹猴

使用CRISPR-Cas9技术创造了一个雄性猴子胚胎和三个雌性猴子胚胎，它们均不表达SIRT6。结果发现，雌性猴子在出生后不久就死亡了，而雄性胚胎在怀孕中期死亡。

缺少SIRT6会导致严重的全身发育迟缓。

相比于野生型新生猴，突变小猴的骨密度较低、皮下脂肪含量较低，肠道和骨骼肌发育未成熟。因此，没有SIRT6会导致子宫内整个身体发育迟缓，并导致无法在出生后存活的“早产”后代出生。

与新生野生型猴子相比，SIRT6 -/-猴子的大脑更小，在大脑和小脑半球的皮质层更薄

似乎SIRT6在猴脑发育过程中充当神经祖细胞分化的介质，而SIRT6的缺失会延迟神经元的成熟。

2. SIRT6缺乏导致大脑和肌肉发育迟缓。

SIRT6缺乏导致大脑发育迟缓。

SIRT6缺乏导致肌肉发育迟缓。

3. 查看crispr是否明显造成indel

因为物种是monkey，所以作者没有走标准的人类相关indel分析流程，也没有使用成熟的indel相关软件，结构变异更没有触及。

从文中方法描述来看，找indel的方法太依赖主观经验，几乎不可能重复出来这个分析流程：

作者使用这样的in house 流程，分析得到的indel结果如下：

4. 转录组数据看看差异表达

作者涉及到的表达器官有点多，而主要分析要点是sirt6敲掉后造成的全身基因表达变化，而不是器官特异性的，所以作者做了大量的两两相比的差异分析得到了大量的显著差异基因列表，然后取交集来缩小范围。

值得注意的是，作者简单粗暴的选择了表达变化最大的那个长非编码基因H19作为下游实验验证的靶标。

5. 缺乏SIRT6的NPC显示延迟神经元分化

通过TALEN介质的基因编辑程序生成了SIRT6−/−人类胚胎干细胞，然后将其分化为NPC。SIRT6−/−NPC 显示延迟神经元分化。经过两周的神经元诱导，PAX6、SOX2和nestin在SIT6中仍然在SIRT6−/−表现较高水平。此外，H19在人类SIRT6−/−神经细胞中比在野生型细胞中更为丰富，这与SIRT6−/−猴子大脑的观察一致。因此，我们利用体外人类神经元分化系统重新概括了SIRT6依赖灵长类神经元的发展。

背后的机制

最终，研究团队发现，SIRT6会去除与H19转录相关的乙酰基。这表明，缺乏SIRT6的人类细胞通过减少H19的表达可以解决其神经分化的缺陷。因此，SIRT6通过抑制H19的表达来调节人类细胞的神经发育，就像猴子一样。

进一步分析显示，SIRT6的缺失改变了各种组织中数千个基因的表达，而H19不太可能是导致缺陷的唯一基因。事实上，一种罕见的发育障碍Silver–Russell syndrome被证实源于H19的过表达，但是与缺乏SIRT6的猴子相反，这类患者寿命很长，且生育缺陷并没有那么严重。这一差异表明，除H19之外，SIRT6调控的其他基因同样与突变猴子的严重缺陷有关联。

04 延伸版块

1. SIRT6基因的作用

SIRT6通常被称为“长寿基因（longevity gene）”，这是因为它在排列蛋白和招募修复DNA断裂的酶方面发挥着重要作用；另外，缺乏这个基因的小鼠过早衰老，而携带这个基因额外拷贝的小鼠则活得更长。这些研究人员猜测如果更有效的DNA修复是更长寿命所必需的，那么寿命更长的有机体可能进化出更有效的DNA修复调节因子。SIRT6活性因此在长寿物种中增强了吗？

SIRT6在每个物种中都不相同。相反，这个基因与长寿共同进化，变得更有效，因此具有更强SIRT6活性的物种活得更长。Bohmann说，“SIRT6蛋白似乎是寿命的主要决定因素。我们证实如果在细胞水平上，这种DNA修复效果更好，那么在有机体水平上，就具有更长的寿命。”

具有更为强效的SIRT6的物种？

Seluanov说，虽然看起来人类SIRT6在功能上已得到优化，但“还有比人类更长寿的其他物种”。这项研究的后续步骤涉及分析那些比人类更长寿的物种---比如可以存活200多年的北极露脊鲸（bowhead whale）---是否已经进化出更为强效的SIRT6基因。

Gorbunova说，最终目标是阻止人类中的年龄相关性疾病。“如果由于DNA因年龄的增加变得杂乱而患上疾病，那么我们就能利用这样的研究来制定可以延缓癌症和其他退行性疾病的干预措施。”

SIRT6的“光环”

从进化的角度来看，SIRT6非常迷人。在所有被研究的哺乳动物中，基因的缺失都会导致过早死亡，而且这种蛋白质具有相同的酶活性，参与葡萄糖代谢和干细胞分化。

然而，在从小鼠、猴子到人类的进化阶梯中，SIRT6缺失所导致的一些特征变得越来越严重——SIRT6缺失小鼠在出生几周至几个月内死亡，缺陷猴子会在几小时内就死亡，而人类甚至于无法活至出生。

这一新发现揭示了SIRT6作为表观遗传因子可以调节灵长类动物的出生前发育，对于深入理解人类因子宫内发育迟缓而导致胎儿流产或新生儿死亡的原因。

2. CRISPR–Cas9 脱靶效应分析

使用Cas-OFFinder软件， 预测可能的脱靶位点。3,891 possible off-target regions were identified, including 983 sites without NAG or NGG PAM sequences.

所有关于全基因组的数据分析，都只是为了在正文提到：Whole-genome DNA sequencing further confirmed the precise targeting of the SIRT6 locus in all three monkeys, without detectable off-target effects across the genome，也就是说没有明显的脱靶效应，IGV截图基因编辑效果如下：

同时人工检测部分预测脱靶位点并且截图展示。

再整理表格说明那些全部的（3,891个）位点情况；