【生信文献200篇】33 sirt6和sirt1调控昼夜节律

00 文献信息

英文标题： Partitioning circadian transcription by SIRT6 leads to segregated control of cellular metabolism

中文标题： SIRT6的昼夜转录分型引起细胞代谢的分离控制

期刊：《Cell》 影响因子： 38.637

研究领域： SIRT6的多组学分析

DOI号： https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.06.050

01 总述

We report that SIRT6 defines the circadian oscillation of a distinct group of hepatic genes, different from the ones under SIRT1 control.

昼夜节律与细胞代谢密切相关。sirtuin家族的创始成员NAD+依赖性脱乙酰基酶SIRT1有助于clock功能。肝脏昼夜节律转录组的比较表明，SIRT6和SIRT1分别调控转录特异性，因此明确划分了昼夜节律基因的类别。

SIRT6与CLOCK:BMAL1相互作用，控制染色质募集到昼夜节律基因的启动子区域。并且SIRT6调控SREBP-1的昼夜染色质募集，从而导致循环调节基因涉及脂肪酸和胆固醇代谢。

通过昼夜节律代谢组分析揭示，该机制与SIRT6缺失小鼠中脂肪酸代谢的表型破坏相似。因此，由两个独立的sirtuins进行的基因组分配有助于昼夜节律代谢的差异调控。

02 背景

SIRT1去乙酰化酶参与生物钟功能，揭示了生物钟和细胞代谢之间的功能联系。

由7个NAD+依赖的去乙酰化酶 (SIRT1-7) 组成sirtuins家族，它们的酶活性和蛋白质靶点的效力不同。且sirtuins在细胞质、线粒体、细胞核和核仁的亚细胞定位各不相同。

sirtuins中，SIRT6 在染色质上的结构定位是独一无二的，它的全基因组占据在活性基因组位点的转录起始位点(TSSs)，与丝氨酸5磷酸化的RNA聚合酶II结合位点一致。

据报道，SIRT6 在响应 TNFα 等刺激时，其染色质结合是动态的，从而改变衰老和应激相关基因的转录景观。SIRT6 去乙酰化 H3K9 (H3 lysine 9)和 H3K56 调节基因表达、端粒维持和基因组稳定性，SIRT6 的组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 活性被发现是核小体依赖的。

SIRT6 也与代谢调节密切相关，SIRT6-/-小鼠在2-4周龄时死亡，原因是糖酵解、葡萄糖摄取和线粒体呼吸速率的改变导致严重加速衰老和低血糖。SIRT6 还以 GCN5 依赖的方式控制 PGC-1α 的乙酰化状态，从而调节血糖水平。肝脏特异性 Sirt6-/- 小鼠发生脂肪肝是由于与脂肪酸氧化和甘油三酯合成有关的基因表达发生改变。

03 实验&数据

实验及数据获得部分

芯片数据 GSE57830 ，使用的是 Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array ，研究团队在6个昼夜周期时间点(0, 4, 8, 12, 16 and 20h)取样，分别是SIRT1,SIRT6突变以及WT小鼠，72个样本数据。(6时间点，3种小鼠(WT有两次)，3个重复)。

把值得关注基因分成4组：

• group 1 represents genes that oscillate in WT (SIRT6) liver and whose oscillation is dampened/disrupted in SIRT6 knockout (KO) mice. (691 genes)
• Group 2 represents genes that oscillate in SIRT6 KO, but not in their corresponding WT littermates. (779 genes)
• Group 3 represents genes that oscillate in WT (SIRT1) liver and whose oscillation is dampened/disrupted in SIRT1 KO mice (SIRT1 KO). (703 genes)
• Group 4 respresents genes that oscillate in SIRT1 KO, but not in their corresponding WT littermates.(1126 genes)

相关实验

Chromatin immunoprecipitation, ChIP

Western Blot Analysis

Plasmids and Luciferase Reporter Assays

数据分析方法

差异基因分析：JTK_CYCLE

因为分组太多，作者使用了JTK_CYCLE 的统计方法

来自于 J Biol Rhythms. 2010 Oct;文章：JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets 。

具体代码下载地址在：https://s3-us-west-2.amazonaws.com/oww-files-public/8/88/JTKversion3.zip 曾老师将其同步更新在：https://github.com/jmzeng1314/GEO/tree/master/task3-multiple-groups

DAVID 在线工具和GO富集分析

代谢组分析验证结果

利用MotifMap 确定转录因子结合位点

04 实验结果

Partitioning of the Circadian Transcriptome by SIRT6 and SIRT1 in Exclusive Subdomains

SIRT6和SIRT1在专属子域中对昼夜转录组的划分

研究人员通过Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array芯片测序并分析差异基因，结果如下(图1AB)：

稍后，研究人员对SIRT6和SIRT1转录组中昼夜节律振荡基因进行GO分析(图1CD)：

最具代表性的生物学过程是转录、转录调控和核过程，在WT肝组和SIRT1 KO肝中均富集，但SIRT6 KO中完全不存在。SIRT6 KO组与WT或SIRT1 KO组在显著选择的生物通路上几乎没有同源性，包括内质网、高尔基体、蛋白质定位/分解代谢、RNA加工和翻译(图1C)。GO分析强调了SIRT6 KO组特有的基因类别，表明肝脏SIRT6的破坏会导致昼夜节律生物学功能的改变。

因此研究人员将重点放在了解这两种sirtuins如何不同地调节不同种类的昼夜节律基因。

依赖于SIRT1/6的共有周期节律相关基因仅有160个，因此，SIRT6和SIRT1调控不同生物类型的昼夜节律基因。如下所示：

对基因表达昼夜节律期的分析显示，SIRT6 KO小鼠在 ZT16 和 ZT20 时出现了基因振荡的峰值，与SIRT6 KO小鼠在 ZT4 和 ZT8 时显著表达的基因不同(图2B)。

根据 rhythmic profile 研究人员确定了不同类型的基因的昼夜节律表达：

1. 在 WT 及 SIRT6 和 SIRT1敲除三种情况下均未发生改变的基因；
2. 昼夜节律表达受SIRT6和SIRT1类似调控的基因；
3. SIRT6或SIRT1敲除时，振幅更强的基因。

由于Sirt6 在Sirt1 KO和Sirt1在Sirt6 KO肝脏中的表达分别被没有改变。因此，研究人员认为通过SIRT6和SIRT1控制昼夜基因的表达似乎定义了参与不同生物学功能的振荡CCG的独特子域。

SIRT6 Interacts with CLOCK:BMAL1 and Controls Their Chromatin Recruitment

SIRT6与CLOCK:BMAL1相互作用并控制其染色质募集

研究人员主要研究了SIRT6控制昼夜转录的分子机制。

虽然BMAL1的表达量未发生改变(图3A)，但在SIRT6缺失的情况下，染色质上的BMAL1关联增强。因此，研究人员分析了启动子特异性的昼夜节律募集机制。

研究人员通过染色质免疫沉淀(ChIP)分析，发现在SIRT1缺失时，Rgs16和Mthfd1l启动子的昼夜节律BMAL1募集未发生改变(图3B和3C)。

启动子及 BMAL1 选择性募集到 Rgs16 和 Mthfd1l 启动子的不同putative E boxes 的示意图如图S5所示：

相比之下，SIRT6的缺失导致Dbp启动子的昼夜节律BMAL1募集(zt4和zt8)显著增加(图3D)。同时Ac-H3K9在所有时间点上都有增加(图3E)。

图S7显示，SIRT6缺失时，Per1和Amd1启动子的BMAL1招募改变。

为了进一步说明SIRT6的作用，研究人员使用Dbp-luciferase(荧光素酶)，发现与SIRT1的结果相似，SIRT6的异位表达导致了CLOCK:BMAL1驱动转录表达受抑制(图3F)。但与SIRT1不同的是：SIRT6通过将clock机制募集到染色质，直接在转录水平上控制昼夜节律功能。

随后，研究人员试图确认SIRT6与昼夜节律转录复合物相互作用。如共免疫沉淀(co-IP)所示(图4A和4B)，SIRT6可以单独或同时与CLOCK和BMAL1相互作用。并且，SIRT6并不通过co-IP直接与SIRT1相互作用(图4B)。当SIRT6单独或同时与SIRT6和SIRT1共同异位表达CLOCK和BMAL1时，SIRT6 IP复合物仅与CLOCK和BMAL1相互作用，而不与SIRT1相互作用(图4C)。

通过分离WT小鼠肝脏，研究人员发现SIRT6的亚细胞定位主要是在核和构成染色质在所有的ZTs中，而SIRT1仅是核没有染色质(图4D)。并且，SIRT6 依赖的与CLOCK和BMAL1的相互作用也在染色质(图4E)。此外，研究人员还进行了连续的co-IP实验证明了两个sirtuins独立地与CLOCK机制相互作用的证据相一致。最后，SIRT1可以使BMAL1在赖氨酸537处去乙酰，而SIRT6则不能(图4G)，这凸显了位于分区亚细胞时钟复合体中的两种sirtuins的不同作用机制。

SIRT6 Controls SREBP-1-Dependent Circadian Transcription

SIRT6控制 SREBP-1-Dependent 的昼夜节律转录

MotifMap (genome-wide maps of regulatory elements) 用于确定SIRT6被破坏时表达谱改变的启动子中转录因子结合位点的富集。与SRF、PPARγ、FOXO或ETS家族基序相比，SREBP结合位点高度富集(137个位点)(图5A)。

随后，研究人员将SIRT6缺失导致表达中断的基因与已发表的ChIP-sequencing数据进行比较，以确定与SIRT6重叠的SREBP-1和SREBP-2基因靶标的范围。除了已经提到的基因，其他SREBP靶点在SIRT6 KO中出现中断，包括 Elovl、Ldlr 和 Aacs 基因。

研究人员将SREBP-1靶基因与SIRT6/SIRT1依赖的靶基因进行了比较，发现SIRT1/SIRT6特异性控制SREBP的生物学功能存在分区。

由于SIRT6 KO肝脏中 SREBP-1c 昼夜转录和蛋白水平没有明显变化(图5B)，研究人员进行了ChIP实验。与WT相比，在SIRT6缺失的情况下，SREBP-1向Fasn启动子(已知的SREBP-应答基因)的生理募集显著增加(图5C)。这种增加在ZT4显著，并先于ZT16的Fasn转录高峰。如图5C和S8所示，Fasn启动子展示了SREBP-1选择性向TSS和阴性控制区域的募集，以及向 Hmgcr 和 Lss 启动子的募集。此外，在大多数ZTs中，Fasn启动子中Ac-H3K9水平增加(图5C)。

研究人员基于上述证据，认为SREBP-1c可能参与Fasn昼夜节律基因的表达。因此，研究人员使用了 WT 和 SREBP-1c KO 小鼠在 ZT4 和 ZT16 的肝脏，观察到 SREBP-1c KO 小鼠肝脏中 Fasn 昼夜节律表达显著下降，而 Dbp 和 RevErbα 昼夜节律表达仍未改变(图5D)。因此，研究人员认为SIRT6可能定义了一类由SREBP-1c调控振幅的基因。

为了从功能上探索SIRT6对srebp -1c介导的转录的影响，研究人员使用了一个荧光素酶报告基因，Fas-Luc 65 MT。与SREBP-1c共表达显示Fasn启动子激活旺盛，而SIRT6的增加则强烈抑制了这一激活(图5E)。重要的是，Fas-Luc -65 MT显示对SIRT6介导的抑制并不敏感。该效应具有特异性，SIRT1不能抑制SREBP-1c驱动的Fasn激活(图5E)。因此，SIRT6参与调节适当的SREBP-1c染色质募集，导致其目标基因的昼夜转录。

Sirtuin-Dependent Genomic Partitioning Results in Differential Circadian Metabolic Phenotypes

Sirtuin-Dependent 的基因组划分导致不同的昼夜代谢表型

代谢组学分析以无偏倚的方式确定SIRT6或SIRT1扰乱肝脏昼夜节律周期的生理后果。

总共有77种代谢物在SIRT6代谢组中表现出基因型依赖效应，142种代谢物依赖于昼夜节律(图6A)。在SIRT1代谢组中，42种代谢物表现出基因型效应，而199种表现出时间依赖性效应(图6B)。总的来说，有85种代谢物只在SIRT6 KO中出现强烈振荡，57种代谢物在SIRT1 KO中显示出强烈的节律性。

将代谢物分为生物功能类，发现SIRT6 KO肝脏中脂质相关代谢物的变化最为显著(图6C)。这些脂质与脂肪酸代谢密切相关，包括脂肪酸合成(中链和长链脂肪酸)的昼夜节律中断、存储、细胞膜脂质和信号转传导。使用 SIRT6 微阵列数据，通过DAVID来识别可能改变的基因表达谱，发现与GO的生物功能与代谢组学数据集相匹配。比较SIRT6中断时的高通量代谢组和转录组数据，发现GO生物学功能间有很强的相关性(图6D)。

与细胞合成或降解有关的脂类在ZT16时出现显著增强的昼夜振荡高峰，并且编码与脂质信号相关的磷脂酶的基因在SIRT6破坏后表现出表达谱的改变，并伴有类二十烷代谢产物节律的改变，这表明 signaling/inflammatory 事件是受SIRT6调控的。代谢物途径与SREBP转录反应的改变相平行，表明SIRT6是脂肪酸合成、储存、分解和信号传导的昼夜节律调节所必需的。

05 延伸版块

组蛋白去乙酰化酶

组蛋白去乙酰化酶调控基因表达、细胞周期、细胞分化，对于治疗癌症等疾病有着巨大潜力。目前在人体中共发现了18种HDAC，根据序列同源性不同被分为4种类型：

• 第Ⅰ类HDAC1~3，8，主要分布在细胞核内；
• 第Ⅱ类HDAC4~7，9，10；
• 第Ⅲ类为sirtuin蛋白家族，包括SIRT1~7
• 第Ⅳ类仅包含一个成员HDAC11.