转录组讲师带你读文献(6)-多发性骨髓瘤微环境

我在我在04-转录组笔记推文任务列表（半年期）里面安排了6个经典综述和10篇转录组应用文献给大家，可惜愿意沉下心了认真苦学的并不多。（https://share.mubu.com/doc/14uneHKvPg）

所以安排转录组讲师给大家做一下领读：

下面是转录组讲师的投稿

文章信息

标题：Dysregulated IL-18 Is a Key Driver of Immunosuppression and a Possible Therapeutic Target in the Multiple Myeloma Microenvironment

标题：IL-18失调是免疫抑制的关键驱动因素，也是多发性骨髓瘤微环境中可能的治疗靶点

杂志：Cancer Cell；April 9, 2018

通讯作者：Ludovic Martinet,2,12,* and Mark J. Smyth1,5,12,13,*

单位：2 图卢兹癌症研究中心；1 QIMR Berghofer医学研究所癌症与感染免疫学实验室；5 昆士兰大学医学院

主要结论

• IL-18通过MDSCs的产生极大地促进了MM的进展
• IL-18驱动的MDSCs在mm相关免疫抑制中起关键作用
• 高BM IL-18水平与MM患者预后不良有关
• IL-18失调可能是MM的潜在治疗靶点

每次看到这些结论的时候心里都特别虚，促进了细胞增殖，浸润，在某某中起到关键作用，与预后相关，可能是潜在某某靶点，特别是这些字眼的时候。不知道你们是怎么看的。你们找到了自己的科研信仰吗？

背景知识

Paraproteinemias：

副蛋白血症患者如骨髓瘤或Waldenstrom大球蛋白血症，虽然出血相对少见，但通常有异常的凝血特征。一些异常症状通常是由于异常副蛋白对血小板和/或凝血因子功能的影响而产生的。一些骨髓瘤患者会出现类似肝素的循环抗凝剂，这可能导致严重的、持续的出血，通常是致命的。

多发性骨髓瘤

是一种常见的血液系统恶性疾病，以异常增殖的克隆性浆细胞为特征，骨痛、肾衰、贫血等是该疾病常见的临床症状。

MM细胞大多表达CD138，CD138是一种对维持细胞形态及其与微环境相互作用等有着重要作用的细胞黏附分子。MM细胞表面CD138低表达是疾病预后不良的重要指征。

生发中心的B细胞受抗原刺激后可分化形成记忆性B细胞与浆细胞，不同分化阶段的细胞具有特定的免疫表型。浆细胞为B细胞分化的终末细胞，B细胞特征性抗原的丢失使得浆细胞表面抗原呈异质性。

正常浆细胞与MM细胞表面抗原也有较大差异，CD38++，CD138+，CD19+，CD45+，CD56-/CD38++，CD19-，CD45-/+，CD56+/-是用于区分良恶性浆细胞的主要免疫分子表型

参考：https://wenku.baidu.com/view/7e7e1fad4b7302768e9951e79b89680202d86b78.html

免疫过程

骨髓中的淋巴干细胞分化过程：

查看源图像

体液免疫与细胞免疫的区别：

数据与方法

• 双端测序，75bp，平台：NextSeq 500 Illumina sequencing platform
• 测序数据分析：
  • 参考基因组：Ensembl GRCh38
  • 比对：STAR
  • 定量：Subread featurecount
  • 标准化：limma包
  • 其他分析：GSEA分析，相关性分析（Pearson）
  • 数据集合：GSE104171
• 生存分析：Overall survival，Kaplan-Meier curves（log-rank tests），survival package，Multivariate analysis，Cox回归分析，ANOVA分析
• 差异表达分析：Mann-Whitney U test or unpaired student t test

RNA-Seq数据：

• non-tumoral CD138- fraction of patient BM（bone marrow） aspirate：病人骨髓抽出物的非肿瘤CD138-部分，即CD138 depleted bone marrow

转录组的标准分析，比较容易复现，基本上看我六年前的表达芯片的公共数据库挖掘系列推文即可；

• 解读GEO数据存放规律及下载，一文就够
• 解读SRA数据库规律一文就够
• 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够
• GSEA分析一文就够（单机版+R语言版）
• 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的
• 差异分析得到的结果注释一文就够

为什么要使用CD138 depleted的骨髓呢？

CD138（Syndecan-1）是syndecan（多聚体蛋白多糖）家族中的4个跨膜糖蛋白之一，能够结合硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素分子。正常情况下，CD138主要在早期前体B细胞、成熟的浆细胞以及多种上皮细胞表达，而其他淋巴细胞则为阴性。在淋巴造血系统肿瘤中，CD138在几乎所有的血浆细胞恶性肿瘤病例中都有表达。 http://www.biolynx.cn/products/methods/antibody/171.html

CD138分子是一种跨膜硫酸肝素糖蛋白，在正常淋巴细胞(如前B细胞、未成熟B细胞和产生胰岛素的浆细胞)分化的不同阶段表达，并在单层上皮细胞中表达。据报道，非典型细胞CD138表达缺失是宫颈癌发生的早期事件，而CD138抗原表达与保留的上皮形态和分化密切相关，而CD138作为免疫组化标记物的主要用途是对浆细胞进行定量。 https://shop.leicabiosystems.com/global_zh_CN/ihc-ish/ihc-primary-antibodies/pid-cd138-syndecan-1

在病理学中的应用：浆细胞肿瘤的诊断

主要结果

有关细胞因子背景知识见：https://www.yuedongxu.cn/posts/2c029ce6.html

1 IL-18对多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)进展至关重要

IL-1家族细胞因子是无菌炎症的重要介质。我们最初的目的是了解IL-1家族细胞因子，特别是IL-1b在MM炎症微环境中的作用。

使用可移植骨髓瘤细胞系测试抗骨髓瘤药物的疗效：注射the Vk*MYC-derived MM cell line, Vk12653 MM到wild-type (WT), Il1r-/-, and Il18-/- mice中。

• WT小鼠：转染Vk12653 MM细胞的WT小鼠表现出进行性副蛋白血症，并且在注射35天后，B220- CD138+ PCs恶性扩张
• Il1r- /-小鼠：与WT老鼠相比,Il1r- /-小鼠显示出类似的paraproteinemia水平，轻微减轻骨髓瘤负担，提示宿主IL-1信号在MM进展中作用有限
• Il18-/-小鼠：有趣的是,相比之下,Il18-/-小鼠并没有显示出明显的paraproteinemia，骨髓瘤后第35天骨髓中pc扩张。同样，Il18-/-老鼠完全防止在小鼠Vk12653 MM在进展期中类似的传播(图就是S1C和S1D)。

与这些结果一致，Il18 -/-老鼠显示延迟MM发展和长期生存的中位生存时间91.5天，而WT和Il1r-/-老鼠中位存活时间为48天。

图注：图A和B分别显示在第21天(A)和35天(B)后血清g-球蛋白水平；图C展示post-MM challenge第35天血清蛋白电泳结果显示副蛋白血症（paraproteinemia）(C)；图D展示具有代表性的CD138+B220 -浆细胞(PCs)频率的流式细胞仪图，图E比例，图F PC数量。(G和H)注射2X10e6 Vk12653 MM细胞(G)或5X10e5 Vk12598 MM细胞(H)的小鼠Kaplan-Meier生存曲线。

总的来说，我们的结果显示IL-18是促进MM进展的一个不可或缺的因素。

2 NLRP1是多发性骨髓瘤(MM)进展的关键

IL-1b和IL-18的分泌主要受到炎症小体的转录后调控。特别是NLRP3炎性小体与包括癌症在内的多种炎性疾病有关。为了评估NLRP3和接头蛋白ASC的参与，我们使用hVk12653 MM 细胞注射到WT, Nlrp3-/-, and Asc-/-小鼠中。与WT小鼠相比，我们发现两个Nlrp3- /-和Asc-/-老鼠的paraproteinemia和BM骨髓瘤负担水平降低。这些结果提示NLRP3和ASC部分参与了MM的进展，NLRP3和ASC独立通路可能与IL-18驱动的MM进展有关。

基于缺乏NLRP1炎性小体phenocopy的小鼠缺乏IL-18的事实(Murphy et al.， 2016)，我们想知道缺乏NLRP1的小鼠是否可以免受MM进展的影响。

我们将Vk12653 MM cells注射进缺乏三种NLRP1 (Nlrp1a-/-，Nlrp1b-/-，Nlrp1c-/-)异构体的小鼠。我们观察到，在post-MM challenge35天，Nlrp1-/-小鼠几乎完全不受paraproteinemia以及在BM中有扩充的PCs。

此外，与Il18-/-小鼠中观测到的一致，Nlrp1-/-也表现出显著的显著延长了存活时间，进一步证明了NLRP1和IL-18之间的关联。

最后还做了一个实验证明，IL-18可能由NLRP1驱动，对MM的进展起着至关重要的作用。

3 在Nlrp1-/-和Il18-/-小鼠中多发性骨髓瘤(MM)依赖CD8+ T细胞控制

一般来说，肿瘤相关炎症通过向恶性细胞提供促生存和增殖信号和/或产生免疫抑制微环境来刺激肿瘤生长，使恶性细胞逃避免疫识别和破坏。为了了解NLRP1和IL-18如何促进MM进展，我们研究了效应淋巴细胞在控制Vk12653 MM中的作用。通过建立没有NK细胞和CD8+细胞的小鼠模型，观察各种指标，

4 IL-18作为一种免疫抑制开关，推动MM进展

CD8+ T细胞的关键需求提出了一种可能性，即宿主来源的IL-18可能限制免疫介导的MM控制，而不是作为MM细胞本身的一种必要的促生存因子。鉴于多种促炎细胞因子可在体外诱导MDSCs，我们推测骨髓细胞源性IL-18可在BM微环境中诱导MDSCs。为了解决这一可能性，我们首先在体外测试了IL-18对细胞因子诱导的MDSCs产生的影响。

5 MDSCs限制MM患者的T细胞应答(RNA-Seq测序数据结果1)

• PMN-MDSC signature genes：ITGAM, ARG1, CYBB, OLR1, FUT4, CEACAM8, S100A8, and S100A9
• cytotoxic lymphocyte signature genes：CD2, CD3E, CD3D, TBX21, CD8B, PRF1, GZMA, and GZMB

如下图所示，我们发现这两个signature genes集合之间负相关。

我们还发现，这两个signature genes集合还可以将MM病人分为两组：MDSC high cytotoxic low group and MDSC low cytotoxic high group

上面的结果提示PMN-MDSCs可能有助于限制MM微环境中细胞毒性T细胞的功能。与这个结果一致的是：在MM患者的BM中，有相当大的一部分细胞表型符合PMN-MDSCs (CD33 + CD11b + HLA-DR-CD15+)。需要注意的是：只有一小部分BM有MO-MDSC表型(CD33+CD11b+HLA-DR-CD14+) 。

6 IL-18增强MM MDSCs的免疫抑制活性(RNA-Seq测序数据结果2)

接下来，我们讨论了IL-18是否与我们在小鼠BM MDSCs中观察到的MM MDSCs的功能成熟有关。为此，我们利用我们的全转录组分析MM的微环境,在MM患者BM内确定了308个基因与IL18基因表达密切相关(相关系数> 0.70,p < 10e-8 )，如下图：

GSEA分析结果显示（Reactome数据库基因通路集合），这些基因与neutrophil/PMN-MDSC显著相关，如下图：

事实上，在MM患者的BM样本中，IL-18 mRNA水平与与经典PMN-MDSCs相关的基因表达密切相关(ITGAM, ARG1, S100A9, CEACAM8，和MMP9)，包括最近鉴定的人类癌症PMN-MDSCs特异性基因(OLR1, RETN, LCN2, CD24, MMP8，和COL17A1)。证实了MM患者BM niche 中IL-18与PMN-MDSCs的关系。如下相关性热图：

7 高水平的BM血浆IL-18预测MM患者预后不良

根据IL-18的表达水平的中值，将病人分为高低组，发现高表达水平组生存时间更短。

8 IL-18失调是MM微环境中一个潜在的治疗靶点

总结

1 文章中使用普通转录组RNA-Seq测序数据的地方主要应用在结果5和6，用相关基因的表达谱对样本进行聚类分析，计算基因与基因之间的相关性分析，并使用相关基因做了功能富集分析（GSEA）。比较矛盾的地方是文章这里说的是93个样本，我去GEO看的时候是94个样本。

2 收获了文章中说的很多signatures

3 将曾经的免疫背景捡了一些回来，都是熟悉的内容，但是已经忘得差不多了。