转录组讲师带你读文献(8)-RNA-Seq与表观组学结合

我在我在04-转录组笔记推文任务列表（半年期）里面安排了6个经典综述和10篇转录组应用文献给大家，可惜愿意沉下心了认真苦学的并不多。（https://share.mubu.com/doc/14uneHKvPg）

所以安排转录组讲师给大家做一下领读：

下面是转录组讲师的投稿

文章信息

• 标题：Sex-specific adipose tissue imprinting of regulatory T cells
• 标题：调节性T细胞的性别特异性脂肪组织印迹
• 发表时间及杂志：Nature，Published online: 26 February 2020
• 通讯作者：Ajithkumar Vasanthakumar和 Axel Kallies
• 通讯作者单位：1 墨尔本大学彼得·多尔蒂感染与免疫研究所微生物与免疫学系；2 墨尔本沃尔特和伊丽莎霍尔医学研究所

数据和方法

测序数据：GSE121838

• RNA-seq：GSE121836
• ATAC-seq：GSE121837

RNA-Seq 和分析

• 测序平台：an Illumina NextSeq 500，75 bps，双端
• 参考基因组：GRCm38/mm10，注释文件：NCBI RefSeq mouse genes
• 比对：Subread aligner
• 定量：featureCounts
• 过滤条件：Genes that failed to achieve a CPM (counts per million mapped reads) value of 0.5 in at least 2 libraries were excluded from downstream analysis
• 标准化及差异分析：limma
• 筛选阈值：FDR<0.1和 FC >1.2

数据样本类别：

• 8个tissue: spleen脾，Treg cells
• 4个tissue: Subcutaneous adipose tissue皮下脂肪组织，Adipose tissue
• 33个tissue: Visceral adipose tissue内脏脂肪组织
  • 4个Adipocytes脂肪细胞
  • 6个Adipose tissue
  • 4个CD4 T cells
  • 4个ILC2
  • 8个Stromal cells基质细胞
  • 7个Treg cells调节性T细胞
• 19个female和26个male

ATAC-seq 和分析

• 测序平台：NextSeq 500 sequencer，75 bps，双端
• 比对：GRCm38/mm10，Subread
• 筛选条件：Only uniquely mapped reads were retained
• ATAC peaks：Homer (v.4.9)，a FDR cut-off of 10^-5^
• peak注释：annotated by assigning them to the nearest gene
• 识别差异区域：FDR < 0.2

数据样本类别：

• 2个female和6个male
• 2个Spleen：Treg cells
• 6个Visceral adipose tissue：
  • 2个Treg cells
  • 2个CD4+ T cells

ChIP–seq analysis

• 比对：GRCm38/mm10，Subread aligner
• peaks识别：Homer (v.4.9)，FDR cutoff of 10-4
• 注释：Peaks were assigned to their nearest gene
• ATAC-seq和ChIP–seq联合：Overlapping peaks at least 1 bp overlap

主要结果

1 Sex-specific VAT T~reg~ cell molecular profile（RNA-seq结果）

visceral adipose tissue，缩写为VAT：内脏脂肪组织

T~reg~ cell：调节性T细胞，介绍及功能可以参考：https://www.ahajournals.org/doi/full/10.1161/atvbaha.114.303568

1）首先是male的VAT中的T~reg~ cell VS spleen的T~reg~ cell ，FDR<0.1，FC>2，筛选到大约3000个差异表达基因。

转录组的标准分析，比较容易复现，基本上看我六年前的表达芯片的公共数据库挖掘系列推文即可；

• 解读GEO数据存放规律及下载，一文就够
• 解读SRA数据库规律一文就够
• 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够
• GSEA分析一文就够（单机版+R语言版）
• 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的
• 差异分析得到的结果注释一文就够

结果如下图：

2）female中的结果，只有305个显著差异表达的基因：

3）第三组差异比较：VAT Treg cells男性VS女性，有1100个差异表达基因。在男性中高表达的基因有：Il1rl1 (encoding ST2), Il10, Ccr2 and Klrg1；Pparg (required for VAT Treg cell differentiation20), Prdm1 (encoding BLIMP1, associated with effector Treg cell differentiation21) and Gata3 。在女性中高表达的有：Sell (encoding CD62L), Cxcr5, Stat1, Foxo1 and Tcf7。

splenic Treg cells男性VS女性，没有差异基因。

4）为了测试不同的转录谱的男性和女性的T~reg~细胞是否反映不同的染色质可及性，进行了ATAC-Seq分析。在VAT T~reg~中我们筛选到了3,833 loci有性别差异，这里面包括Il1rl1, Il10, Pparg and Klrg1，这几个基因也在VAT Treg cells的转录组层面性别差异中。

2 T~reg~ cell extrinsic sex-hormonal function

性激素是许多发育过程的中心，并在脂肪组织中富集。

3 VAT inflammation recruits T~reg~ cells

1）男性（h图）：VAT皮下脂肪组织 比 SV-AT内脏脂肪组织

2）皮下脂肪组织（i图）：男性比女性，总共有1300多个差异表达基因，在雄鼠中高表达的有contribute to inflammation (Tnf, Ccl2 and Il1b) ，tissue fibrosis(Col6a5)，prostaglandin metabolism (Hpgds)。

4 Sex hormones control IL-33^+^ stromal cells

5 BLIMP1 controls VAT T~reg~ cell genes

总结

此文章应该是RNA-Seq与其他组学组合应用的一篇文章，如ATAC-Seq，ChIP–seq。