不容错过的6分+预后模型套路
题目：Development of a four-gene prognostic model for clear cell renal cell carcinoma based on transcriptome analysis
基于转录组数据构建肾透明细胞癌的四基因预后模型
摘要
本研究基于转录组数据构建了肾透明细胞癌的预后模型，作者下载GEO和TCGA数据库的ccRCC转录组数据和临床特征。差异分析鉴定到533个ccRCC发育有关的关键基因，随后进行WGCNA分析鉴定差异基因和临床特征的关系。基于PPI网络，LASSO分析和Cox回归分析构建四基因预后模型。使用KM生存分析和ROC曲线研究该模型的能力。作者发现该预后模型与免疫细胞浸润显著相关。该预后模型可以作为一种准确性较高的预后预测工具。
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流程图
结果
1. 数据的获取和整理
从GEO数据库下载ccRCC的芯片数据（GSE14994,GSE15641, GSE16449,GSE36895, GSE46699,GSE53757,GSE71963和GSE126964）。从TGCA数据库下载514例ccRCC样本和72例正常样本的转录组数据和临床数据。
2. GEO数据分析
作者使用“renal cell carcinoma”和“human tissue”作为关键词筛选GEO数据库中的ccRCC数据集，共下载8个ccRCC数据集。使用R包“Affy”和“Simpleaffy”对这些数据集进行分析。共包含220例正常组织和381例ccRCC组织。对每个数据集进行差异分析并筛选，共得到948个DEGs，包括408个上调基因和540个下调基因，排名前10的DEGs如图1A所示。对DEGs进行GO分析如图1B所示。这些基因大多数与肾脏，肿瘤免疫微环境和跨膜通道蛋白发生发展有关。
图1 差异基因鉴定和GO分析
2. TCGA数据分析
对TCGA数据集进行差异分析，共鉴定到5298个DEGs，包括3091个上调基因和2207个下调基因。对DEGs进行GO分析如图2A和图2B所示。作者发现两个数据库中的DEGs并不完全相同，结果表明肾和血管发生，肿瘤免疫微环境和跨膜转运在ccRCC发育中起到重要作用。
图2 TCGA数据集的DEGs的GO分析
3. DEGs和临床特征的相关性
作者对两个DEGs取交集，共得到533个DEGs，包括189个上调基因和344个下调基因。为研究基因与临床特征的相关性，作者进行WGCNA分析。由于WGCNA分析需要的基因数量较大，因此作者对TCGA数据集鉴定到的5298个DEGs进行分析（图3）。绿色模块与大部分临床特征有关，年龄仅与红色模块有关，性别仅与绿色模块有关。这些结果表明，转录失调可能与年龄和性别无关。然而，总生存期和N期与大多数模块显著相关，总生存期与模块的相关性较高。因此，作者接下来重点研究总生存期。
图3 WGCNA分析
4. 筛选ccRCC生存相关的基因
为筛选533个DEGs中的核心基因，作者构建PPI网络。图4A为DEGs的PPI调控网络。使用MCODE插件筛选最显著的cluster（图4B），以鉴定关键基因。这些关键基因在ccRCC发育中起到重要作用。最终，筛选到100个核心基因。
图4 筛选ccRCC生存相关基因
为筛选ccRCC生存相关的潜在基因，作者将TCGA数据集分为训练集和验证集。进行单因素Cox回归分析，得到31个生存相关的基因。随后进行LASSO分析，得到11个基因。最后使用多因素Cox回归分析，最后得到4个基因（表1）。风险打分=0.63 × COL4A5 - 0.34 × ABCB1 – 1.08 × NR3C2 – 0.51 × PLG（图4E）。
表1 肾透明细胞癌的4个独立预后因子
5. 预后模型生存分析和验证
根据风险打分，作者将训练集分为高风险组和低风险组（图5A）。训练集的生存情况如图5B所示风险打分越高预后越差。KM生存分析表明高风险组的总生存期显著较低（图5C）。ROC曲线预测1年和3年的AUC面积分别为0.8205和0.7552（图5D）。作者将高风险组中死亡患者定义为真阳性，将低风险组中死亡患者定义为假阴性，将高风险组中存活患者定义为假阳性，将低风险组存活患者定义为真阳性。TCGA训练集的敏感性为74.71%，特异性为62.35%，阳性预测值为50.39%，阴性预测值为82.81%。
对验证集进行相同分析，根据风险打分将患者分析高风险组和低风险组（图5E）。高风险组预后价差，死亡患者较多（图5F和5G）。ROC曲线的1年和3年生存期的AUC分别为0.7573和0.6711（图5H）。结果表明该预后模型可以准确预测ccRCC患者的预后。
图5 TCGA数据集的生存分析
6. 四基因预后模型的独立验证
为进一步验证预后模型的准确性，作者使用GSE29609数据集进行验证。根据风险打分将患者分为高风险组和低风险组（图6A）。高风险组的预后较差（图6B和6D）。这四个基因的表达水平如图6C所示。其中，NR3C2在低风险组的表达水平较高，而ABCB1, COL4A5和PLG的表达水平没有差异。ROC曲线的1年和3年的AUC面积分别为0.7634和0.7006（图6E）。
图6 预后模型的验证
7. 四基因预后模型与免疫细胞浸润的相关性
GO分析已经表明DEG与免疫微环境有关。为研究四基因预后模型与免疫细胞浸润的相关性，作者浸润GSEA分析。结果表明，高风险组和低风险组富集多种免疫相关信号通路。使用CIBERSORT分析TCGA数据集的免疫细胞比例。随后进行免疫细胞与风险打分的相关性。风险打分与naïve B细胞，将细胞， CD4+ T细胞，树突状细胞，NK细胞，单核细胞和肥大细胞负相关（图7），而CD8+ T细胞，Treg细胞，巨噬细胞M2和中性粒细胞与风险打分正相关（图7）。免疫检查点分析表明，PD-1和CTLA-4表达水平与风险打分正相关，而PD-L1与风险打分负相关。以上结果表明四基因预后模型与免疫细胞浸润有关。
随后作者研究该模型对不同免疫细胞浸润的患者的预后价值，KM生存分析表明低风险组患者的将细胞，CD8+ T细胞，CD4+ T细胞，巨噬细胞M1，巨噬细胞M2，树突状细胞，NK细胞，单核细胞，中性粒细胞和肥大细胞的比例更高。总的来说，四基因预后模型可以通过免疫细胞浸润预测总生存期。
图7 预后模型和免疫细胞浸润的相关性
结论
作者首次基于转录组数据构建了ccRCC的四基因预后模型。高风险组患者的总生存期较短，这可能与肿瘤微环境中抑制性免疫细胞较多，非特异性免疫细胞浸润较少有关。总的来说，该预后模型可以作为一种准确性较高的预测ccRCC患者预后的预测工具。本研究存在的局限性在于没有进行实验验证和基因突变等相关分析。