【生信文献200篇】50 scRNAseq-CAFs
00 文章信息
英文标题： Spatially and functionally distinct subclasses of breast cancer-associated fibroblasts revealed by single cell RNA sequencing
中文标题： 通过单细胞RNA测序揭示了乳腺癌相关成纤维细胞在空间和功能上的不同亚类
期刊：《Nature Communications》
影响因子: 14.919 发表时间: 2018-12-04
研究领域： 单细胞转录组测序 肿瘤微环境 空间异质性
DOI：10.1038/s41467-018-07582-3
01 总述
癌症相关的成纤维细胞 （CAFs）是肿瘤微环境的主要组成部分。研究人员遵循反向选择策略结合单细胞RNA测序技术，获得了来自基因工程小鼠乳腺癌模型768个间充质细胞的转录组信息，定义了CAFs的三个不同亚群。癌症和人肿瘤的实验样本在转录水平和蛋白质水平揭示了CAFs亚群在空间上的分离可归因于不同的起源，包括血管周围微环境、乳腺脂肪垫以及转化的上皮细胞。每一种CAF亚型的基因谱与其独特的功能过程相关，并且通过与转移性疾病相关联，发现在临床上有独立的预示性能力。因此研究人员得到结论，广泛定义的CAF群体分辨率的提升为生物标志物驱使的CAFs精确靶向药物开发提供了可能性。
02 背景
CAFs
癌症相关的成纤维细胞（CAFs）被认为是肿瘤微环境主要组成部分且被证实是多种癌症的标志。并且CAFs显示出有多种来源包括常驻成纤维细胞、骨髓来源的间充质干细胞、周细胞以及经历了间充质转变的恶性细胞或内皮细胞。目前缺乏全面具体的细胞标志物来区分CAFs。
反向选择策略：
本文是指利用荧光激活细胞分选技术（FACS）来分离除上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和周细胞之外的其他细胞。
03 实验数据及方法
数据
样本来源：乳腺癌模型小鼠中分离的768个CAFs细胞
数据是公开的：GSE111229
代码：GitHub [www.github.com/KPLab/SCS_CAF].
最终得到10835个内源性基因和53个质控基因
TCGA数据库乳腺癌RNA-seq数据
部分实验方法：
基于反向筛选的FACS(EpCAM−/CD45−/CD31−/NG2−)
Smart-seq2
降维分析：主成分分析（PCA） 和 t-SNE
GO注释
部分R包
R包SC3：进行分群
R包scran：细胞周期分析
04 结果
单细胞RNA测序揭示了乳腺CAFs亚群分类
研究人员采用单细胞RNA测序技术来检测从乳腺癌模型MMTV-PyMT小鼠的肿瘤中分离出的间质细胞。由于CAF缺乏统一标志物，研究人员采用了反向筛选策略，使用荧光激活细胞分选技术（FACS）来分离除上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和周细胞之外的其他细胞（图1a，b）。
对每个CAFs样本的scRNA-seq文库进行建库，使用Smart-seq2方法并且在细胞裂解液中加入ERCC来质控。经过滤后得到10835个内源性基因和53个质控基因用于进一步下游分析。每个细胞含有平均大约4600不同基因的转录本（图1c）。为了研究这一群分离出的CAFs细胞是否能够代表不同细胞亚群，研究人员用不同方法进行了降维，通过t-SNE将细胞明确分为由DBSCAN定义的四群，表明了CAFs亚型的存在，且具有离散的基因表达谱（图1d）。
CAFs亚群有不同的基因程序
研究人员研究了细胞亚型中CAFs标志物表达情况。虽然在每个细胞中检测到了至少一个CAFs标志物的表达，但是大多数细胞仅表达非特异性间充质标志物转录物Vim和Sparc，说明需要一个更好的能够描绘CAFs群体一般性和独特性的分子（图1e）。
Pdgfra由群体2中的细胞特异性表达，而Pdgfrb由除群体4之外的所有细胞表达，Fap，S100a4（编码FSP-1）和 Acta2 （编码α-SMA）在所有的四群CAF群体中都有表达。另外，如FACS数据所示，CAF的两个主要亚型，即群体1和群体2，细胞大小也不同。进一步表明细胞亚群具有独立生物物理特性（图1f）。为了确认能聚类，研究人员使用了SC3的R包，结果得到了与之前t-SNE方法得到的相似的分群。
由于细胞外基质（ECM）的产生和修饰是成纤维细胞的关键功能，研究人员分析了包含在matrisome中的编码ECM蛋白的基因的转录情况，以寻求CAF亚群的生物学验证。结果发现，每个CAF群体都具有特定生物学功能的独特基质。为了能检测差异表达基因特异区分每一个CAF亚型，研究人员对定义的群体进行了再生性优化检验统计（ROTS）。将每个群体与其他聚集的群体进行比较以发现独特的基因特征，并且将FDR小于0.001的上调基因认为是显著差异表达（SDE）。之后，研究人员用每个群体的前150个SDE基因通过GO来定义基因特征（图2b）。
群体1的SDE基因显著性富集在血管发育和血管生成的GO集（图2b），因此将这种亚型称之为血管CAFs（vCAFs）。由于明显的ECM特征，群体2中的细胞被命名为基质CAF（mCAF）。群体3细胞被称为周期CAF（cCAF）。基于SDE基因，群体4检测到的基因集与细胞分化相关，也与发育及组织形态形成有关，将这一亚型标记为发育CAFs（dCAFs）。
vCAF起源于血管周围
由于vCAF中的SDE基因与参与血管发育的基因密切相关，研究人员研究了内皮细胞（如Cdh5，Pecam1，Cd34和Tie1）典型标志基因的表达，以排除vCAF群体的污染。结果发现，分析的细胞中没有找到内皮细胞标志物有意义表达的任何证据（图2c）。
相反，vCAFs的SDE基因集包括了血管调节基因，例如Notch3，Epas1， Col18a1和Nr2f2。除了控制血管生成的基因以外，转录因子和参与细胞连接的基因也在vCAF特点转录组中显著表达（图3a）。研究人员用desmin作为标志物，证实了MMTV-PyMT小鼠肿瘤基质部分中有高丰度vCAFs（图3b）。与肿瘤前缘相比，肿瘤核心的间充质基质细胞vCAF阳性标志物的比例明显更高（图3b）。与它们的功能明显一致，vCAF主要位于脉管系统附近，如vCAF标志物Nidogen-2和内皮细胞标记物CD31的免疫染色所示（图3c）。研究人员进一步在来自原位移植模型的肿瘤中检测到了Nidogen-2阳性基质细胞。
因此，基于它们的组织学定位，研究人员得出结论，vCAF亚群源自血管周细胞群体，其随后在肿瘤进展过程中侵入肿瘤基质。
mCAF是驻留成纤维细胞的后代
肿瘤基质的mCAF子集特异性表达多种ECM相关基因的转录本（图3e）。另外，mCAF大量表达免疫细胞吸引因子CXCL14，提示其对调节肿瘤免疫应答有一定作用。mCAF标志物Fibulin-1和PDGFRα的免疫染色显示，在肿瘤侵袭前沿中，Fibulin-1和PDGFRα阳性细胞普遍存在，而肿瘤核心中mCAF的丰度相对较低（图3f）。两种mCAF标记物Fibulin-1和PDGFRα鉴定出人乳腺癌组织的肿瘤基质中有mCAF大量浸润（图3g，h）。其中mCAF分别占总CAF群体的40.3％和20.0％，89.0％的成纤维细胞通过FACS检测非转基因FVB/N小鼠乳腺表达的mCAF标志物来分离（图1d和3i，j）。
基于mCAFs和正常乳腺中主要的成纤维细胞群有相似标志物表达，研究人员得出结论，mCAF可能源自肿瘤衍生的常驻成纤维细胞。
cCAF是vCAF的增殖部分
使用matrisome基因集的SC3聚类证明了cCAF和vCAF聚集在一起。实际上，仅仅发现细胞周期基因在cCAFs和vCAFs之间有差异表达（图3k）。此外，对增殖标志物Ki-67的免疫染色证明，分裂的基质成纤维细胞主要存在于vCAF的巢中，而不是mCAF，因此确定了cCAFs 的位置并认认定cCAF确实是目前参与细胞分裂的vCAF。得出结论，cCAF代表了vCAF的增殖片段；基于它们在分离时的相对丰度，vCAF群体中7.7％的细胞被分离了。
dCAF与肿瘤上皮细胞有共同的表达模式
除了具有独特的ECM基因谱外，dCAF还根据各种干细胞相关的基因的表达来区分（图4a），与组织发展中推测的功能保持一致。由特异性标志物SCRG1分离出的dCAF在MMTV-PyMT小鼠的肿瘤组织中是比较少的，与从原始肿瘤中分离的该亚型的细胞数量较少的结果一致（图1d和4b）。在dCAF中强烈检测到转基因PyMT致癌基因的表达，表明了该细胞亚群的恶性细胞来源（图4c）。
总之，dCAF SDE基因在肿瘤上皮细胞和基质间充质细胞中的重叠表达表明dCAsF可能源自经历过上皮-间质转化（EMT）的肿瘤细胞。
CAF亚群表示组织学上不同的实体
为了最终证明在恶性病变中存在空间上不同的CAF亚群，研究人员通过使用荧光报道分子或免疫染色直观显现所有亚组。实际上，同时检测vCAF标志物Nidogen-2，mCAF标志物PDGFRα和dCAF标志物SCRG1，鉴定了三种不同的基质群体，这三种群体具有与肿瘤细胞巢相关的不同生长模式和定位（图4d）。为了更好地显示CAF亚群和肿瘤的其他组成成分，使用了双光子共聚焦显微镜。结果再次显示了由特异性标志物鉴定到的三个不同CAF群（图4e）。
CAF亚群是独立的预后生物标志物
接下来要开始确定是否可以在来自人类患者样品的大量RNA-seq数据中鉴定出之前观察到的CAF亚型。
使用TCGA数据库乳腺癌RNA-seq数据，在每个CAF亚型的SDE基因中鉴定出了高度相关的基因，统计了vCAFs的7个基因和mCAFs的30个基因的精简基因集。进一步表明在人乳腺肿瘤中也存在CAF亚型（图5a）。此外，基因集在其他癌症的RNA-seq数据中也具有高度和特异性相关性，表明在不同恶性肿瘤中CAF发展有一定程度的共性（图5b-d）。
为了确定vCAFs和mCAFs功能上不同的基因程序是否也可以从TCGA数据库的大量数据分析中被辨别出来，研究了每种细胞亚型的精练基因谱与其推断功能的meta基因之间的相关性，即血管生成和ECM生成的调节。与来自小鼠肿瘤的数据一致，vCAF特征与乳腺肿瘤中的内皮细胞meta基因高度相关，而mCAF特征与ECM meta基因非常相关（图5e-h）。
CAFs被认为是确定癌症患者预后关键参数的重要调节物，包括肿瘤进展，转移性接种和对治疗的反应。来自病例对照研究数据集的研究显示，vCAFs的基因特征与内皮细胞meta基因及微血管特征强烈相关，而mCAFs则与基质来源的侵袭特征和基质相关的治疗预测特征高度相关（图5i）。最后，为了得到分析结果显示出的vCAFs和mCAFs侵袭作用的实验相关性，研究人员在细胞迁移系统上接种了从MMTV-PyMT小鼠分离出的PeRo-Bas1乳腺癌细胞。与单独细胞培养基相比，vCAFs和mCAFs均显著增加了通过基质侵入下室的癌细胞数量（图5j）。
总之，vCAFs和mCAFs的基因谱在大量RNA测序数据中很容易检测到，并且对人类肿瘤具有生物学和临床意义。