Illumina上机前处理及测序全网最全教程！

我感觉看着这个教程自己做应该是没什么问题了。我已经把我知道的所有细节都写清楚了。

本教程主要针对16s这类文库，供参考使用。具体的操作流程还是以Illumina的官方文件为准。

Illumina 机器及试剂介绍

仪器

Illumina测序仪可包括三个部分：Flow cell，试剂及界面。

开机之后就会直接进到这个界面：

上面那个就是sequence测序，左下是perfrom wash仪器清洗。我们一般只会用到这两个。

试剂

共需要三个试剂盒的试剂。

1.是测序试剂盒，包含上机测序需要的各种试剂，以及HT1缓冲液。600 cycle就是2*300 bp；500 cycle就是2*250 bp的盒子。

2.装了测序时使用的Buffer及Flow cell。Flow cell保存在盐溶液中。

3.装了上机前变性需要的NaOH，Phix，和EBT。

其中1和2是必备试剂盒，3号不是测试必备试剂盒，而是最开始安装时调试用的。一般NaOH是自备，PhiX需要单独购买，是个小包装，和这个试剂盒不一样。

这三个盒子上的沙漏表示溶剂过期时间。据别人经验，过期一年内问题不大，还能使用(但是可能会影响测序质量Q)。

1和3需要放在-20度保存。1需要在提前一天从-20放到4度解冻。如果忘了，可以当天直接常温用水泡1.5h。

2一直存放在4度。

注意事项&仪器保养

注意事项

1. 提前开好空调，控制房间温度和湿度！！！

温度和湿度极大地影响试剂效果和光路。温度高测序速度下降，且质量不好。

机器自带制冷装置，理想温度是2-4度。但是一般实验室温度不可能这么低，放测序试剂的地方一定要低于11度，温度符合条件才能测序。

Flow cell温度不能太高，影响测序过程中的升降温，延长测序时间。

湿度大不仅会影响光路，还会使得flowcell上面凝结水滴，导致测序直接失败。

如果机器不用了，即使关了，空调也要一直开着！

界面最下面两个温度，左边是测序试剂地方的温度；右边是Flow cell温度

2. 搬运仪器的时候需要锁住零部件，要让工程师来做。否则机器可能出问题，影响光路。

仪器维修：

仪器的液路和光路可能会出现问题，这时候需要工程师来检查和维修。

机器拆开后的样子。那个黄黄的一坨就是泡沫，用于机器自带制冷的保温。

液路检查，大概半个小时。

先生成Bubble，再全部跑一遍检查。如果都是Pass就没问题。

光路检查，在旁边拍了两张，不明觉厉。

这个需要illumina公司做好的特殊Flow cell，所以这一步我们自己肯定做不了。Z轴（上下）偏差在0.135-0.195之间可以接受。太大说明光路偏差太大，需要调节光路。

仪器清洗

进入主界面后点Perform wash，会出来几个清洗选项。

清洗的时候需要在buffer的瓶子加超纯水，平时放在仪器里的Wash tray所有孔里也要加满超纯水。

Post run wash：每次用完仪器后都要做一下；

Maintance wash：等于3次 post run wash。每次wash~16ml （准确值17.25 ml），一次Maintance wash应该出来48ml废液 (51.75ml)。这个每个月要做一下；

Standby wash: 如果超过7天不用的话就要做一下。

上机前的文库前处理及变性

这一大块最是麻烦的，也是上机前花时间最长的步骤。

文库准备

正常样本的处理过程如下：

-提DNA

-PCR

-切胶回收

-测单个样本浓度

-一定数量样本(~50)混合为一个测序文库

-Qubit定量每个测序文库

-建库过程

-跑胶确认条带正确

-每个文库Qubit定量，测准浓度

需要知道的几个信息

扩增产物+建库adaptor后的总长度；

文库浓度；

每个文库样本量；

每个文库序列类型（16S；ITS；功能基因）

哪些文库更重要，一定要测出来。

可以建立一个表：

文库的稀释与混合

好了，接下来可以开始准备工作了。

-首先要将定量的文库浓度（ng/uL）转化为文库摩尔数（nM），公式为：

浓度*10^6/660/片段长度

其中330为单碱基摩尔质量，双链DNA*2为660。

得到摩尔数后先要稀释到4 nM。这个数是Illumina规定的，必须是4 nM。

（如果上机浓度大于10pM小于20pM，起始变性的文库的浓度是4nM。如果上机浓度小于10pM ，起始变性的文库可以是2nM）

稀释的时候用超纯水稀释。稀释后再用Qubit定量。误差在20%以内就行。

-摩尔数转化为浓度公式：

4*660*片段长度/10^6

公式说明：

稀释完，就要根据数据量；文库的重要性以及片段长度将所有文库按照不同比例混合了。

-哪个文库需要的数据量越多，比例要越高；

-Illumina上机片段长度一般为中值是450bp，一般范围是200-700，大于700bp的长度就要相应减小上机浓度，以保证更好地数据产出。密度如果太高，长的太多了可能会导致Flow cell上的簇一致性比较差，由于片段长，两个簇离得近，在反转的过程中会相互交叉，可能多个簇长到一起，也会降低测序质量Q值。

-文库越重要，比例要越高，保证能多测数据。

如果自己实在拿不准，可向有经验的人请教。

上表最后一列根据这个比例填进去。

把所有文库混到一个小管中，为4 nM的总文库。

变性

变性需要上面做好的文库和Phix一起变性。

Phix：

考虑文库的碱基均衡度需要添加Phix。如一次测序全是16S序列的话，序列同一个位置可能是同一个碱基的几率很高。这样的话荧光全是一个信号，太强了不利于成像。因此需要加入Phix平衡碱基，使每个位置都有不同的碱基。

Phix正常可加10%，非常不均衡可以加到25%。

Phix为10 nM，先取2uL Phix+3uL EBT，稀释为4 nM。（这一步可用EBT或者无核酸酶的水，不能用HT1）

NaOH为2N的，需要先稀释到0.2N。如5uL NaOH+45uL 水。（不要只取1uL稀释，误差太大）

然后5uL的文库和5uL的Phix分别加入5uL NaOH，室温放置5 min变性。

之后两者分别加入990 uL的HT1，这样就构建好了20 pM的文库和Phix。体系为1000 uL。

一般来说20 pM浓度有点高，可进一步将文库和Phix用HT1稀释到16 pM（个人经验，可根据片段类型调整）。再加入250 uL的HT1就好了。

如果要加25%的Phix，可取450 uL文库，加入150 uL Phix。

总体积不要小于600 uL就行。因为最后测序需要加入的总体积为600 uL。

注意：

1. NaOH稀释好及最后上机前，最好测一下pH。两次pH值大约为~13和~8。如果上机前这一次pH偏高，需要重新稀释及混合试剂。
2. HT1会剩下来很多，尽量不要留着下次接着用，可能会引入污染。
3. 测序试剂盒用之前要颠倒混匀。之后要从下面看，确认每个孔都没有气泡。
4. 将上述600 uL溶液加入试剂盒左上标有Load sample的孔，确认不要有气泡。

Flow cell

Flow cell装在一个盐溶液的小管中，拿出来用超纯水反复冲洗，把盐溶液都冲洗干净。

然后用擦镜纸小心地擦干净待用。

变性过程还可参考Illumina官方文档：

Denature and Dilute Libraries Guide

上机

建立sample sheet

先打开Illumina experiment manager软件，点create sample sheet.

选择测序仪：

因为我们是扩增子测序，要的是Fastq文件，category选Other，Application选Fastq Only.

测序试剂盒的编号要完全正确且唯一。机器可以识别出来是不是真的，是不是用过的，以及啥时候会过期。

文库类型选哪个都行。

Index类型根据自己使用的选就行。我们用的是单端Index就选1。双端选2。

Cycle数，填的数字要+1，即我们是2*300的盒子，写301，最后测序出来的序列长度为301。如果是250的盒子，写251。

右边选项默认选最后两个，测序完按照Index将不同的文库拆分出来。

然后把文库的名字以及对应的Index填进去就行了。Illumina有两种Index，分别是6个碱基和8个碱基。可以直接在下拉菜单中选Illumina的Index，也可以自己输进入。

这个Index即使填错了也没关系，等测序结束后重新输入进去再拆分样本就可以了。

放入各种试剂

直接点击Sequence，数据是否要连网上传，不用选：

把flow cell放进去：

把测序试剂放进去：

把buffer和废液瓶放进去：

确定文件存放位置：

再确认一下测序信息：

最后一步程序自检，等几分钟全是对号没有问题就可以Start Run了~

测一个碱基~4min。如果是2*250 bp的测序，大概整个流程需要40h。2*300 bp时间就更长些。

测序开始之后~2.5h成簇，即Cluster Density值会显示。再过一会Clusters Passing Filter(簇通过率)，Estimated Yield(估计测序产量)以及Q30的比例都会出现。

Cluster Density推荐是V2的盒子950-1200，V3盒子1200-1400，但是对于16S碱基不均衡文库，建议簇密度在1000左右比较好。密度太低是序列没有成功的“长”在Flow cell上，最后产物会很低。密度太高表明长的太多了，荧光信号太强同样不利于成像，测序结果也不好。

其他参数值当然越高越好。

测序之后

测序完成后别忘了进行Post wash。下机以后是需要0.5%的吐温20清洗2次后，再超纯水清洗后放置。

测序试剂盒的废液有毒，不能直接倒入下水道，需存放在装废液的地方。

要查看测序质量信息，可在Illumina Sequencing Analysis Viewer这个软件中进行。

打开后需要导入同一个文件夹中的三个文件：

在左上角分为四块：

Analysis中有各种质量信息：

Imaging一般用不到，Summary总结了测序的产出，错误率，Q30比例等信息。Read1和Read3分别是正向和反向序列；Read2(I)是Index。

最后一个Indexing包含了测出来的Phix的比例，以及每个文库的产出。

到此，Illumina上机测序全流程就结束了。

之前写过两篇文章介绍测序相关内容：

测序踩的坑

MER：评估Miseq测序仪测序质量的工具