【生信文献200篇】59 利用DNA甲基化和RNA-seq分析获得乳腺癌DNA甲基化调控基因

00 文章信息

英文标题 Identification of epigenetic modulators in human breast cancer by integrated analysis of DNA methylation and RNA-Seq data

中文标题 DNA甲基化和RNA-seq数据的综合分析鉴定人乳腺癌的表观遗传调控

期刊《EPIGENETICS》

影响因子 4.523 发表时间 2018-08-07

研究领域 RNA-seq DNA甲基化 表观遗传 乳腺癌

DOI： 10.1080/15592294.2018.1469894

01 总述

研究人员将TCGA中乳腺癌的DNA甲基化数据和RNA-Seq数据与7个数据库的DNA基序信息进行整合，寻找与乳腺癌异常DNA甲基化相关的DNA结合蛋白及其结合基序。

在乳腺癌中共检测到42850个差异甲基化区域(DMRs)，其中包括77298个CpG位点。在DMRs中发现了108个DNA基元，并确定了109个基因编码与这些基元结合的蛋白质。基于这些基序和基因，研究人员确定了63个甲基化调节基因，构建了63个调控基因和645个转录因子的网络，确定了20个网络模块，并发现了乳腺癌相关的通路和基因集。63个甲基化调节基因可能在乳腺癌CpG位点异常甲基化中发挥重要作用并为乳腺癌提供表观遗传标记。

02 背景

CpG islands、CpG shores、CpG open seas

CpG islands 是指G/C含量大于55%且大于500 bp的区域;

CpG shores 是CpG密度较低的区域，位于CpG岛的0 ~ 2 kb之间;

CpG open seas 是距离任何CpG岛屿4kb的区域。

甲基化和CpG

DNA中胞嘧啶碱基的甲基化主要发生在CpG dinucleotides 环境中，并在连续几轮细胞分裂中保持稳定。

在正常发育过程中，多数来自配子DNA的甲基在受精后被清除，然后在 implantation 时，出现了 denovo 甲基化修改了基因组中除CpG岛外的几乎所有CpG。implantation 后，甲基化的变化以位点特异性方式发生，可能涉及某些基因的从头甲基化或去甲基化。

在正常细胞中，大多数CpG发生甲基化。甲基化主要发生在低密度CpG区域。含有高CpG和C:G含量的基因组区域称为CpG岛，通常是未甲基化的。

然而，在人类癌细胞中，广泛的低甲基化发生在低密度 CpG 区域，特别是在相对于 LAD （lamin-associated domains）和 LOCK（ large organized chromatin lysine modifications）区域块中，而高甲基化以位点特异性方式发生在 CpG 岛和 CpG shores。

由于CpG岛通常位于脊椎动物基因组的启动子区域，启动子区域CpG岛的高甲基化可以使基因的表达沉默。表观遗传沉默是编码肿瘤抑制因子、DNA修复酶和参与其他细胞/调节途径的蛋白质的基因在人类癌症中失活的一个重要机制，这意味着表观遗传沉默可能参与了癌症的开始和进展。

03 流程及数据

流程图：

具体过程：

1. 数据预处理：对 Illumina 450K 甲基化芯片进行归一化并SVA去批次效应。
2. 差异分析：检测肿瘤与正常组织的DMRs。
3. 通过层次聚类确定协同调控的DMRs，并确定每个DMRs聚类中显著富集的DNA结合蛋白基序。
4. 结合基序在DMRs中富集的蛋白的基因表达水平与DNA甲基化相关，并据此确定DMRs的甲基化调节基因。
5. 网络分析，找出与调控基因相关的网络模块。

数据

TCGA中516个BRCA的DNA甲基化数据（level 1），及临床信息。

TCGA中498个乳腺癌RNA-seq数据（level 3）。

研究人员选择了DNA甲基化数据中的94对匹配的乳腺癌(BRCA)样本和正常组织样本进行差异分析。并且在94对配对样品（188个）中，有171 个样本同时具有 RNA-Seq 和 DNA 甲基化数据。

7个数据库：

hPDI、JASPAR、UniPROBE、StamLab、Jolma、CIS-BP、Hocomoco

利用motifDb软件对7个数据库中所有DNA结合蛋白的DNA基序检索，得到DNA基序的位置加权矩阵(PWMs)。

04 结果

Differentially methylated CpG sites in breast tumors

在94对乳腺癌(BRCA)样本和配对的正常组织样本中，发现了42,850个差异甲基化区域(DMRs)，其中包括77,298个CpG位点（FDR≤10-3），12853个DMRs在肿瘤中甲基化水平高于正常组织，29997个DMRs低于正常组织。

研究人员分析了DMRs在基因组的分布，发现高甲基化DMRs与低甲基化的DMRs均在CpG open seas中富集。并且DMRs富集在gene body中，几乎不出现在启动子部分。

Motifs of DNA-binding proteins enriched in DMRs

之前研究表明，CpG位点周围DNA序列（约1000 bp）中蛋白结合基序的突变决定着CpG位点的甲基化水平。

研究人员首先进行了 DMRs聚类分析，然后搜索每个聚类中富含的 DNA 基序。

42850个DMRs被聚类为高甲基化和低甲基化两个簇。当Pearson’s correlation 阈值为0.6时，有66个clusters。

利用FIMO算法在66个聚类中的DMRs周围的1000 bp长的DNA序列中寻找富集的DNA基序。鉴定了108个DNA基序和109个与这些基序结合的蛋白质。

图2给出了由一个蛋白质结合的前10个基序和编码其结合蛋白的基因名称。除了STAT1和SP1这两个基因外，这10个基因都是甲基化调节基因。

Modulator genes for DMRs

为了确定 DNA 结合蛋白在调节 DNA 甲基化方面是否具有功能相关性，研究人员使用线性回归模型来测试编码 109 种蛋白质的基因表达水平与富含蛋白质基序的 DMR 簇中 CpG 位点的甲基化水平之间的相关性。

利用这171个样本的基因表达和DNA甲基化数据进行相关性分析。图3为产生最小P值的16个基因的相关分析结果。总之，研究人员共鉴定出79个基因的表达水平与相应DMRs的甲基化水平显著相关。

之后，研究人员用同时具有 RNA-Seq 和 DNA 甲基化数据的其余327个组织样本作为独立数据，验证79个基因的表达水平与相应DMRs甲基化水平之间的相关性。结果发现79个基因中63个的相关性在验证数据中仍然显著。因此，研究人员将63个基因命名为DNA甲基化调节基因（具体基因信息在补充文件3中）。

除 STAT1 和 SP1外，富集DMRs 的结合基序 的8 个属于 63 个甲基化调节基因。有3个基因(ESR1, FOXP1, SMAD4)曾被研究表明为癌症驱动突变的基因。

为了观察DNA甲基化调节基因的表达水平是否可以预测相应CpG位点的甲基化水平，研究人员采用多元线性回归模型，将66个DMR聚类中每个CpG位点的平均甲基化程度与结合基序在DMR聚类中富集的调控基因的表达水平拟合。

研究人员首先用训练数据拟合模型，之后通过验证集预测DMR聚类的平均甲基化水平。结果表明相关基因的表达水平具有很好的预测相应CpG位点甲基化水平的能力。

Network modules of methylation modulator genes

为了更好地了解这63个甲基化调节基因对DNA甲基化的影响，研究人员进行了网络分析。

基于 DNA 基序和基因表达数据，使用 FIMO 和 ACRANE 构建了一个由 964 个编码 DNA 结合蛋白的基因组成的网络。

由63个甲基化调节基因组成的网络，产生了一个包含 708 个基因和 1,275 个方向边缘的网络。（图4）63个甲基化调控基因表现出明显高于其他基因的外度中心性，表明这些调控基因对其他基因具有重要的调控作用。

在这个网络中，有16个基因是63个甲基化调控基因的调控基因，629个基因是63个甲基化调控基因的靶标。16个调控基因分别是ZFX、TBX1、USF2、RREB1、EGR2、SREBF2、WT1、MNT、TFAP4、ZNF740、SPIC、EGR4、SP1、CLOCK、ETV1和THRA。

癌症驱动突变的 DNA 结合蛋白的 18 个基因中有 15 个包含在 708 个基因中；它们是 TP53、MYC、GATA3、CBFB、MDM2、ESR1、FOXA1、BRCA1、CTCF、DNMT3A、FOXP1、XBP1、SMAD4、CUX1、PRDM1。

采用基于edge-betweenness 的群落检测方法获得了20个网络模块，并对甲基化调控基因扩展网络中的20个网络模块进行了检测。

在20个模块中，有16个模块中有一个或多个甲基化调节基因是中心节点，这意味着甲基化调节基因可能在调控其他基因中发挥重要作用。

为了深入了解这些网络模块的功能影响，研究人员最后从MSigDB中C2人类基因集中寻找每个模块富集通路。在FDR≤0.05的20个网络模块中，共发现29个MSigDB C2基因集富集：