【生信文献200篇】65 狼疮性肾炎患者肾脏免疫细胞图谱

00 文章信息

英文标题 The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis

中文标题 狼疮性肾炎患者肾脏免疫细胞图谱

期刊 《NATURE IMMUNOLOGY》

影响因子 25.603 发表时间 2019-12-17

研究领域 肾癌 单细胞

DOI 10.1038/s41590-019-0398-x

01 总述

研究人员使用单细胞转录组测序分析了来自狼疮性肾炎患者和健康对照受试者的肾脏样本，揭示了 21 个在疾病中活跃的白细胞亚群，包括多个骨髓细胞、T 细胞、自然杀伤细胞和 B 细胞，它们表现出促炎反应和炎症解决反应。 研究人员发现 B 细胞局部激活的证据与年龄相关的 B 细胞特征相关，以及肾脏内单核细胞分化的渐进阶段的证据。并在大多数细胞中观察到明显的干扰素反应。两种趋化因子受体 CXCR4 和 CX3CR1 被广泛表达，意味着在细胞运输中具有潜在的核心作用。尿液和肾脏中免疫细胞的基因表达高度相关，这表明尿液可以作为肾脏活检的替代物。

02 背景

狼疮性肾炎(LN)是自身免疫性疾病，是系统性红斑狼疮(SLE)的一种常见并发症。

目前对SLE分子通路失调的认识主要来自血细胞的无偏分析;然而，血液在多大程度上反映了炎症组织尚不清楚。

该文中的免疫细胞主要是 myeloid cells, T/NK cells, B cells, dividing cells or epithelial cells等。

03 数据及方法

分组情况

LN患者和健康人的肾脏（kidney）、尿液（urine）和血液（blood）样本

样本准备

研究人员按照图a的流程分析肾脏和尿液样本的细胞成分和分子状态的方法。

转录组分析

研究人员使用cell - seq2处理细胞，并使用了McCarroll实验室开发的改进版本的Drop-seq方法。

cell clustering： Seurat (v1.4.0.8)

轨迹分析：基于扩散图降维，Destiny(v2.6.2)

趋化因子/细胞因子受体分析

趋化因子/细胞因子受体的分析基于从国际基础和临床药理学联盟 (IUPHAR) 和英国药理学会 (BPS) 数据库下载的受体-配体对列表及已发表文献。

实验数据

研究参与者的临床和血清学数据，均存放在 ImmPort 存储库中（登录代码 SDY997）

原始单细胞 RNA-seq 数据存放在 dbGAP（登录代码 phs001457.v1.p1）

04 结论

Isolation and processing of kidney cells for single-cell transcriptomics

研究人员分析了 24 名 LN 患者和 10 名对照样本的肾活检。结果发现约一半的 LN 样本的白细胞产量远高于对照样本，包括 B细胞、T细胞、巨噬细胞和其他白细胞。

研究人员使用改良的 CEL-Seq2 方案（CEL-seq方法的升级版）将活细胞分选到 384 孔板中进行单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)。对 2,736 个白细胞和 145 个上皮细胞的基因表达数据进行主成分分析表明，数据变异的主要来源与细胞类型有关。

a）LN和对照活检样本中作为单个细胞分类的白细胞数量。b）LN活检中按肾小球肾炎分级分类的白细胞数量。c）流式细胞术评估活检样本中B细胞、T细胞、单核细胞/巨噬细胞或其他白细胞的比例。d）活检样本中B细胞在白细胞中的百分比 e）通过主成分分析(PCA)预测肾细胞在PC1-PC2(左)和PC2-PC3(右)平面的基因表达数据。f）与(e)相同，不同之处在于细胞是基于384孔板着色的。

Stepwise cell clustering identifies cells of the myeloid, T, natural killer (NK), B and epithelial lineages

研究人员采用逐步分析方法(stepwise approach)，基于基因表达结果进行聚类分析。所有肾细胞的低分辨率聚类确定了 10 个簇：髓细胞（C4 和 C6 簇）、T/NK 细胞（C0、C1、C2 和 C5）、B 细胞（C3、C8）、分裂细胞（C9）和肾上皮细胞（C7）。

研究人员分别对每个谱系的细胞进行聚类，并确定了 21 个免疫细胞簇和一个上皮细胞簇（图 2a）。

The renal and systemic interferon responses are highly correlated

狼疮患者外周血中Ⅰ型干扰素水平升高。为了评估这种现象在肾脏中的程度，研究人员计算了每个细胞的干扰素反应评分 —— 几个已知干扰素刺激基因（ISGs）的平均表达。

研究人员发现，与活体供体对照相比，除1例患者外，所有患者肾脏细胞中该评分均显著上调，并在所有簇中也均呈上调(图2c)。

包含 B 细胞和 CD4 T 细胞（CB3 and CT6）的两个簇表现出特别高的干扰素反应评分值。这些细胞中的大部分来自两名患者（患者 ID 200-0841 和 200-0874）。 并且这两名患者还具有干扰素评分明显较低的 B 细胞和 CD4 T 细胞，表明这种细胞因子的分泌可能用于空间上定位。研究人员比较来自 10 名 LN 患者的匹配血液和肾脏样本中的干扰素反应评分，并发现显着相关性（图 2d），表明干扰素（升高）反应主要发生在肾外。

Classification and annotation of myeloid cell clusters reveal resident and infiltrating populations

研究人员对髓样簇 C4 和 C6 中的 466 个细胞进行了重点分析，并发现了 5 个更精细的簇（簇 CM0-CM4）。

研究人员将全局基因表达模式与使用 scRNA-seq 在健康个体的血液样本中鉴定的已发表的，并通过经典谱系标记的参考单核细胞/树突细胞 (DC) 簇的基因表达模式进行比较来确定假设结果（图 3b, c）。

根据典型 DC 标记 CD1C 和 FLT3 的表达以及单核细胞标记 CD14 和 CD16 的缺失表达，CM3 簇最接近 CD1C DC 或 CLEC9A DC。簇CM0 细胞与 CD16 最相似，具有非常高的 CD16 (FCGR3A) 和 CX3CR1 表达及 CD14 和 CCR2 的低表达。

在簇 CM1 和 CM4 中发现了相似的结果。CM1 细胞表达的 CX3CR1 和 CD16 水平低于 CM0，而 CM4 细胞表达甚至更低水平的这两种基因和更高水平的 CD14 和 CD64 (FCGR1A)，但与经典的 CD14 单核细胞不同。这三个簇（CM0、CM1和CM4）可能代表浸润性肾脏单核细胞/巨噬细胞亚群，因为它们构成了正常肾脏中少数骨髓细胞。

研究人员接下来确定了每个簇中的基因表达模式是否可以表示功能。

CM1 簇与吞噬相关，CM0簇具有最高水平的炎症基因表达。CM4 表达了许多与选择性激活的巨噬细胞相关的基因。CM2是在正常肾脏中发现的主要簇，它可能与稳定状态的肾脏巨噬细胞相对应。

Trajectory analysis identifies a continuum of intermediate states spanning patrolling, phagocytic and alternatively activated monocytes

使用轨迹图（图 3d）或tSNE进行的降维表明三个浸润单核细胞/巨噬细胞簇之间可能发生转变。

由于簇 CM0 中的细胞往往与外周血 CD16 单核细胞最相似，而簇 CM4 中的细胞最不相似，因此可能是从炎症性血液单核细胞（CM0）到 吞噬（CM1），然后是交替激活（CM4）表型。

但研究人员发现炎症基因NFKB1的表达沿着CM0到CM4的轨迹逐渐减少，CD36（吞噬细胞受体）诱导的关键信号受体MERTK的持续升高。即沿着这条轨迹观察到炎症基因的普遍下调和与吞噬作用相关的基因的同时上调。

为了进一步研究假设的肾内转变，研究人员分析了两名肾脏中具有大量 CM1 和 CM4 细胞的患者（患者 ID 200-0873 和 200-0874）的血液样本。共产生了 1,411 个分选的高质量髓系血细胞，其中包括 CD16 单核细胞亚群。研究人员将这个亚群中每个细胞的基因表达数据与髓样肾簇的基因表达数据进行了比较。发现绝大多数外周血 CD16 细胞与 CM0 簇最相似，少数细胞映射到 CM1 或 CM3，没有细胞映射到 CM4 或 CM2。此外，研究人员发现在肾脏中，与 CM0 相比，簇 CM1 中吞噬作用相关基因的相对上调。

这些分析与肾脏内 CD16 单核细胞分化为 CM1 和 CM4 细胞一致，但不排除少量血细胞的分化以及选择性迁移到肾脏中。此外，这些集群之间的其他过渡方案（或不存在）也是可能的，需要进一步研究。

LN kidneys contain two clusters of NK cells and three clusters of CD8+T cells

簇C0, C1, C2和C5，包括1764个细胞，含T细胞和NK细胞。将它们分成7个更精细的NK、CD8+T和CD4+T细胞群（簇CT0-CT6）。

簇 CT1 包含 NK 细胞。CD8+细胞簇CT2中存在类似细胞毒性程序，表明细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 身份。第二组CD8+ T细胞聚集在簇CT4中，并表达出较高的GZMK。与簇 CT2 相比，这些细胞表达的 PRF1 水平相对较低，并且还表现出 HLA-DR/DP/DQ 分子和 CCR5 的高表达。

簇 CT5 可以进一步分为两个亚簇（图 4b）：第三个 CD8+ T 细胞群（簇 CT5a）和一小群 NK 细胞（CT5b）。簇 CT5a中的细胞具有resident memory cells 的特征，簇CT5b细胞具有NK细胞的特点。

据报道，SLE 患者外周血 CD8+ T 细胞中的耗竭特征与较低的发作率相关，并且在狼疮小鼠的肾脏中也检测到这种耗竭的 T 细胞。但在研究人员的数据中，三个CD8+T细胞簇 (CT2, CT4, CT5a) 仅表达低水平的典型衰竭标志物。

Analysis of CD4+ T-cell subsets identifies five clusters, including TFH-like cells

CT0、CT3和CT6簇包含CD4+T细胞。CT3可分为两个亚群：CT3a表达与T调节（Treg）细胞相关基因，CT3b）由低FOXP3的细胞组成，特征与 TFH 细胞相似。

集群CT0细分为两个亚群，第一个亚群包含效应记忆CD4+T细胞(CT0a)，第二个亚群主要由CCR7+SELL+TCF7+中央记忆T细胞(CT0b;图4 d)。

两组细胞中CD69表达相似，表示CT0b细胞比初始CD4+T细胞更有可能成为中心记忆。与CT0a细胞的晚期效应表型相反，TCF7、KLF2和LEF1的表达可能表明CT0b细胞具有早期中央记忆T细胞(Tcm)表型。值得注意的是，CT0a 是唯一在活体供体样本中发现的频率很高的 CD4+ T 细胞簇。 该簇的差异表达分析表明 LN 样品中 ISG 的失调。

尽管一些LN肾脏T细胞之前被标注为TH1和TH17细胞，但在研究人员的数据中，CD4+ T细胞并没有分离成具有典型效应谱系特征的集群。与其他T细胞相比，CT6簇包含的CD4+T细胞显示出异常高的ISGs。

Analysis of B-cell clusters reveals age-associated B cells (ABCs)

★ B细胞簇分析显示年龄相关B细胞(ABCs) ”

对435个定位于C3和C8簇的细胞进行分析，发现LN样本中有4个不同的B细胞簇，但健康肾脏中几乎没有B细胞簇(簇 CB0-CB3)。CB1 簇包含浆母细胞/浆细胞，簇 CB3 中的细胞表现出高水平的几种 ISG。

簇CB0 细胞的活化标志物表达上调，表明激活的 B 细胞身份。并且研究人员在该簇中检测到与衰老和自身免疫相关的 ABCs一致的基因表达特征。

基于据报道在 ABCs 中差异表达的一组基因，研究人员为簇CB0 中的每个细胞计算了一个分数，代表其基因表达模式与 ABC 预期的匹配程度。 在集群 CB0 中可以观察到该分数的连续范围的值，而没有明显分离成不同的亚群。 每个患者的 ABC 评分，计算为每个患者 CB0 细胞的 ABC 评分的平均值，与年龄没有正相关性，表明这些细胞的存在确实反映了疾病而不是年龄。

研究人员将簇 CB2 中的细胞分成两个亚簇：CB2a表达 B 细胞标志物 CD19 和 CD20（MS4A1），CB2b表达已知在浆细胞样 DC中上调的基因。

Trajectory analysis reveals intermediate states between naive B cells and ABCs

使用扩散图可视化 B 细胞的基因表达数据，结果发现初始B细胞 (CB2a) 和激活B 细胞 (CB0) 成连续的状态（图 5d-f）。并且，从 CB2a 到 CB0 的轨迹与 ABC 分数的持续增加相吻合（图 5g），表明激活和分化为 ABCs 是高度相关的过程。但很少有细胞处于血浆和初始或活化 B 细胞之间的中间状态，这与发炎肾脏中缺乏分化为浆细胞的情况一致。

然而，由于之前有人提出 ABC 是前浆细胞，这个问题需要额外的调查，特别是使用 B 细胞受体 (BCR) 谱分析。

The dividing cell cluster includes T and NK cells

簇C9 包含三个子集群。 其中两个（CD1 和 CD2）表现出线粒体基因和与应激反应相关的基因水平上调，表明生存力和/或质量较低，因此被排除在后续分析之外。簇 CD0 表明参与细胞分裂的基因水平升高。 通过与 FANTOM5 比较，其细胞分类为 CD8 T 细胞、NK 细胞和 CD4 T++reg 细胞。

Cluster-specific expression of genes associated with disease risk

全基因组关联研究 (GWAS) 已在 SLE 和 LN 中确定了许多风险等位基因及其易感基因。研究人员分析了这些基因在肾脏中鉴定的 22 个簇中的表达。

最后，研究人员分析确定了先天和适应性免疫细胞亚群表达的几种与SLE相关的转录因子，包括 ARID5B、CIITA、ETS、IKZF1、IKZF2、IRF7、IRF8 和 PRDM1。

Expression patterns of chemokines and cytokines

研究人员分析了趋化因子和细胞因子受体的表达模式，重点研究了至少1个集群中相对较大比例(> 30%)的细胞表达的受体。

结果发现单趋化因子受体 CXCR4 在几乎所有簇的大多数浸润细胞中表达。 第二种趋化因子受体 CX3CR1 在大多数骨髓细胞以及 CD56dimCD16 NK 细胞（CT1 簇）和 CTLs（CT2）中表达。 先前涉及 LN 的其他趋化因子受体（例如 CCR5、CXCR3 和 CCR2）的表达频率要低得多。

对于细胞因子受体，研究人员发现IL2RG几乎在所有簇中都经常表达。TGFBR2也在大多数细胞上表达。IL10RA、IL27RA、IL17RA 和 TNFRSF1B 由除 B 细胞外的所有细胞簇中的大部分细胞表达。

为了鉴定作用于发炎肾脏的细胞之间的潜在相互作用，研究人员分析了相应配体的表达模式。

结果发现CXCR4配体CXCL12主要在CM4簇的细胞以及上皮细胞中表达。后者也是 CX3CR1 配体 CX3CL1 的主要来源。CM4 细胞还是 CCL2 和 CCL8 的主要生产者；这些是 CCR2 的配体，它在大部分浆细胞（CB1 簇）和 pDC（CB2b 簇）中表达。

以上结果表明：肾脏上皮细胞和 M2 样巨噬细胞可能正在协调浸润肾脏的免疫细胞的运输。

Comparison of urine and kidney leukocytes

从 LN 患者的尿液样本中分离出的白细胞以与肾细胞相同的方式进行处理，共从 8 名患者中收集 577 个高质量细胞进行后续分析。

研究人员首先将每个尿细胞分配到基因表达数据最相似的肾脏簇。与肾脏相比，尿液样本具有更高频率的髓样细胞（特别是 CM1 簇）和更少的 T 细胞。接下来比较了相应的尿液和肾脏簇中的基因表达。 观察到高相关性，表明尿细胞可用于估计肾脏对应物的基因表达。