背景介绍
肝脏,是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官,并在身体里面充分扮演着去氧化,储存肝糖,分泌性蛋白质的合成等。肝脏是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞,5000个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形,有6-8个面,不同的生理条件下大小有差异,如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。
肝脏的主要连接成分主要是结缔组织,因此我们选择使用胰蛋白酶对肝脏进行第一轮解离,枯草芽孢杆菌蛋白酶可水解天然和变性蛋白,并且在碱性条件下具有活性。我们使用其对肝脏组织进行进一步解离。
为了保存小鼠肝脏完整的基因表达谱,我们将成年小鼠肝脏置于冰上进行解离。小鼠肝脏第一层由0.25%胰蛋白酶在4℃下离解离10min,第二层解离由添加地衣芽孢杆菌酶,胶原酶及DNase I 组成的混合酶。解离产率为5000cells/mg,存活率大于等于93%(以AO/PI计数为标准)。
名称 | 厂家 | 货号 |
---|---|---|
1×DPBS | Thermo·Fisher | 14190 |
胰蛋白酶 | Thermo·Fisher | 15400054 |
牛血清白蛋白 | 无要求 | 无要求 |
EDTA | final | A8806 |
地衣芽孢杆菌酶 | Sigma | P5380 |
4 型胶原酶 | Worthington | 无要求 |
脱氧核糖核酸酶 | 无要求 | 无要求 |
红细胞裂解缓冲液 | Sigma | R7757 |
移液管和枪头 | 无要求 | 无要求 |
离心管 | 无要求 | 无要求 |
培养皿 | 无要求 | 无要求 |
冰袋 | 无要求 | 无要求 |
血细胞计数仪 | 无要求 | 无要求 |
离心机 | 水平离心机 | 无要求 |
注意:肝脏组织中杂质及碎片较多,且肝细胞容易破裂;所以解离过程中要注意根据实际情况适当下调。富集细胞时的离心力,为达到彻底清洗碎片和杂质的目的,在解离过程中使用的解离酶浓度和强度不宜过高,获取的单细胞悬液如果用于单细胞测序,则需要在获取细胞悬液之后尽快进入下游建库,避免因细胞破裂引入RNA 污染问题,从而影响测序数据质量。