PCR

PCR技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

实验原理：

该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

RT-PCR实验

RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，体系更加单一比较利于PCR的进行。一般我们选择的引物与试剂盒都是在同一家公司订购。

具体步骤：

1.试剂及仪器：目的基因及内参引物， RT-PCR反应试剂盒（RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0，TaKaRa）, DEPC(Sigma), 纯净水（去离子水），EB（Sigma），5×Loading Buffer；胶冰，低温高速离心机，RCR反应扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。

2.引物设计：EML4-ALK variants 1 ( EML4 exon 13 fused to ALK exon 20, 247bp）: Fusion – RT - S 5_-GTG CAG TGT TTA GCA TTC TTG GGG -3；Fusion – RT – AS 5_-TCT TGC CAG CAA AGC AGT AGT TGG -3。EML4-ALK variant 3 (EML4 exon 6 — ALK exon 20, 155/188bp): EML4-ex6F 5_-GCA TAA AGA TGT CAT CAT CAA CCA AG-3。人类GAPDH引物（138bp）已商品化并由TaKaRa公司提供。也可以自行设计glyceraldehyde -3 - phosphate dehydrogenase (GAPDH) - S 5_ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3 ， GAPDH – AS 5-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3。

3.RNA提取：可选用RNA提取试剂盒或采用TRizol法。

4.RT: 按照所购试剂盒里说明书及实验者所需的条件选择适当的反应体系。

合成cDNA的引物可结合实际情况从Oligo dT-Adaptor Primer、Random 9 mers或Control R-1 Primer中任选一种。

1）按下列组分配置RT反应液

2）按以下条件进行反转录反应

PCR反应

1)按下列组成配制PCR反应液。

2)按以下条件进行PCR反应。

补充说明：退火温度 ：可根据实际样品情况调整退火温度，通常可以在55℃～65℃范围内进行反应条件研讨。有时可以在更广范围内（45℃～65℃）进行条件研讨。延伸时间 ：延伸时间因目的序列长度的不同而不同，通常TaKaRa Ex Taq® HS按72℃ 1 kb/min设定延伸时间。循环次数 ：cDNA量较少时，循环次数可增加为40～50次。PCR产物可在-20℃冰箱保存。

5.琼脂糖凝胶电泳：取PCR产物5μl 加5×Loading Buffer 1-2μl与加入1μlEB的 2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件120V，100mA ， 30min， 凝胶成象仪成象并保存结果。如下图所示，EML4-ALK在非小细胞肺癌与非肿瘤肺组织患者的样本：A.variant 1 (EML4 exon13-ALK exon 20) B. GAPDH C. variant 3 (EML4exon 6 – ALK exon 20)。左侧标记为扩增片段大小（bp）,右侧为基因名称；“T”表示肿瘤组织样本，“N”表示非肿瘤肺组织样本；“C” 是阴性对照。有条带显示则为该检测基因有表达，反之则无表达。

注意事项：

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2. RT按要求做，一般不会出太大问题。

3. PCR过程如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变RNA浓度、退火温度能解决的。

real-time PCR实验

所谓Real-Time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。real-time PCR技术即实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已经被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。